Технические характеристики ко 206: Лаповый снегопогрузчик КО-206АН – описание и характеристики, цена, купить в “МассАвто”

Содержание

Технические характеристики автомобилей Peugeot 206 / Пежо 206

Peugeot 206 (2C;2H(2009)) 2009 – 2012 гг.

Марка и модификация Тип кузова Объем Мощность Выпуск
Peugeot 206+ 1.1 хэтчбек (3 дв.) 1124 см3 60 л.с. 2009 – 2012
Peugeot 206+ 1.4 хэтчбек (3 дв.) 1360 см3 75 л.с. 2009 – 2012
Peugeot 206+ 1.4 HDi хэтчбек (3 дв.) 1398 см3 70 л.с. 2009 – 2012

Peugeot 206 (2A;2J(2009)) 2009 – 2012 гг.

Марка и модификация Тип кузова Объем Мощность Выпуск
Peugeot 206+ 1.1 хэтчбек (5 дв.) 1124 см3 60 л.с. 2009 – 2012
Peugeot 206+ 1.4 хэтчбек (5 дв.) 1360 см3
75 л.с.
2009 – 2012
Peugeot 206+ 1.4 HDi хэтчбек (5 дв.) 1398 см3 70 л.с. 2009 – 2012

Peugeot 206 (2007) 2007 – 2009 гг.

Марка и модификация Тип кузова Объем Мощность Выпуск
Peugeot 206 1.4 седан (4 дв.) 1360 см3 75 л.с. 03.2007 –   2009
Peugeot 206 1.6 седан (4 дв.) 1578 см3 110 л.с. 03.2007 –   2009

Peugeot 206 (2E;2K) 2002 – 2006 гг.

Марка и модификация Тип кузова Объем Мощность Выпуск
Peugeot 206 SW 1.1 универсал (5 дв.) 1124 см3 60 л.с. 06.2002 – 10.2005
Peugeot 206 SW 1.4 универсал (5 дв.) 1361 см3 88 л.с. 10.2003 – 04.2006
Peugeot 206 SW 1.4 универсал (5 дв.) 1361 см3 75 л.с. 06.2002 – 12.2006
Peugeot 206 SW 1.4 HDi универсал (5 дв.) 1398 см3 68 л.с. 06.2002 – 12.2006
Peugeot 206 SW 1.6 универсал (5 дв.) 1587 см3 109 л.с. 06.2002 – 12.2006
Peugeot 206 SW 1.6 HDi универсал (5 дв.) 1560 см3 109 л.с. 05.2004 – 12.2006
Peugeot 206 SW 2.0 универсал (5 дв.) 1997 см3 135 л.с. 06.2002 – 11.2004
Peugeot 206 SW 2.0 HDi универсал (5 дв.) 1997 см3 90 л.с. 06.2002 – 12.2004

Peugeot 206 (2D) 2000 – 2006 гг.

Марка и модификация Тип кузова Объем Мощность Выпуск
Peugeot 206 CC 1.6 кабриолет (2 дв.) 1587 см3 109 л.с. 09.2000 – 04.2006
Peugeot 206 CC 1.6 HDi кабриолет (2 дв.) 1560 см3 109 л.с. 04.2005 – 03.2007
Peugeot 206 CC 2.0 кабриолет (2 дв.) 1997 см3 136 л.с. 09.2000 – 04.2006

Peugeot 206 (2C;2H) 1998 – 2006 гг.

Марка и модификация Тип кузова Объем Мощность Выпуск
Peugeot 206 1.1 хэтчбек (3 дв.) 1124 см3 60 л.с. 10.1998 – 10.2005
Peugeot 206 1.4 хэтчбек (3 дв.) 1361 см3 75 л.с. 10.1998 – 12.2007
Peugeot 206 1.4 HDi хэтчбек (3 дв.) 1398 см3 68 л.с. 04.2003 – 04.2006
Peugeot 206 1.6 хэтчбек (3 дв.) 1587 см3 88 л.с. 10.2003 – 04.2006
Peugeot 206 1.6 хэтчбек (3 дв.) 1587 см3 109 л.с. 04.2003 – 12.2006
Peugeot 206 1.6 хэтчбек (3 дв.) 1587 см3 110 л.с. 12.2000 – 04.2003
Peugeot 206 1.6 HDi хэтчбек (3 дв.) 1587 см3 109 л.с. 05.2004 – 04.2006
Peugeot 206 1.9 HDi хэтчбек (3 дв.) 1868 см3 69 л.с. 10.2001 – 04.2003
Peugeot 206 1.9 HDi хэтчбек (3 дв.) 1868 см3 70 л.с. 07.2000 – 10.2001
Peugeot 206 2.0 хэтчбек (3 дв.) 1997 см3 177 л.с. 04.2003 – 08.2006
Peugeot 206 2.0 хэтчбек (3 дв.) 1997 см3 136 л.с. 12.2000 – 11.2004
Peugeot 206 2.0 хэтчбек (3 дв.) 1997 см3 135 л.с. 04.1999 – 12.2000
Peugeot 206 2.0 HDi хэтчбек (3 дв.) 1997 см3 90 л.с. 04.2003 – 10.2005
Peugeot 206 2.0 HDi хэтчбек (3 дв.) 2000 см3 90 л.с. 12.2000 – 10.2003

Peugeot 206 (2A;2J) 1998 – 2006 гг.

Марка и модификация Тип кузова Объем Мощность Выпуск
Peugeot 206 1.1 хэтчбек (5 дв.) 1124 см3 60 л.с. 10.1998 – 10.2005
Peugeot 206 1.4 хэтчбек (5 дв.) 1361 см3 75 л.с. 10.1998 – 12.2008
Peugeot 206 1.4 HDi хэтчбек (5 дв.) 1398 см3 68 л.с. 04.2003 – 04.2006
Peugeot 206 1.6 хэтчбек (5 дв.) 1587 см3 88 л.с. 10.2003 – 04.2006
Peugeot 206 1.6 хэтчбек (5 дв.) 1587 см3 109 л.с. 12.2000 – 12.2006
Peugeot 206 1.6 HDi хэтчбек (5 дв.) 1587 см3 109 л.с. 05.2004 – 04.2006
Peugeot 206 1.9 HDi хэтчбек (5 дв.) 1868 см3 69 л.с. 10.2001 – 04.2003
Peugeot 206 1.9 HDi хэтчбек (5 дв.) 1868 см3 70 л.с. 07.2000 – 10.2001
Peugeot 206 2.0 хэтчбек (5 дв.) 1997 см3 136 л.с. 12.2000 – 11.2004
Peugeot 206 2.0 хэтчбек (5 дв.) 1997 см3 135 л.с. 04.1999 – 12.2000
Peugeot 206 2.0 HDi хэтчбек (5 дв.) 1997 см3 90 л.с. 04.2003 – 10.2005
Peugeot 206 HDi 2.0 хэтчбек (5 дв.) 1997 см3 90 л.с. 1999 – 2006

Автомобильный каталог содержит описание, технические характеристики и фотографии автомобилей Peugeot 206 / Пежо 206, выпускаемых с 1997 г.

Продажа подержанных автомобилей Peugeot 206

Отзывы владельцев автомобиля Peugeot 206

  • 19.01.2009

    КИТ2

    Оценка автора

    Объективность

    Купил в “Арманде” в 2004 году Дизайн:5 Оптика:5 Качество покрытия кузова:5 Дизайн:5 Эргономика:5 Практичность отделочных материалов:5 Вместимость:4

    подробнее
  • 15.01.2009

    roottok_28082006

    Оценка автора

    Объективность

    (Где, когда купил) Москва, Авес. 2007 г.в. Дизайн:5 Оптика:4 Качество покрытия кузова:4 Дизайн:5 Эргономика:5 Практичность отделочных материалов:5 Вместимость:5

    подробнее
  • 27.10.2009

    @[email protected]

    Оценка автора

    Объективность

    (Где, когда купил)Леонар авто(август, 2007г) Дизайн:5 Оптика:5 Качество покрытия кузова:5 Дизайн:5 Эргономика:5 Практичность отделочных материалов:4 Вместимость:4

    подробнее

ООО ” Опытный механический завод “

Заказать

Лаповый снегопогрузчик КО-206М предназначен для погрузки в транспортные средства снега, скола, а так же уплотненного снега и льда, предварительно собранного в валы, на дорогах с усовершенствованным покрытием. Двигаясь вперед, снегопогрузчик отделяет из вала лапами питателя снег, который подает на скребковый конвейер и загружает в кузов самосвала, следующего за погрузчиком.

 Снегопогрузчик обеспечивает эффективную эксплуатацию в районах с умеренным климатом и работоспособен при температурах до -30оС. Ограничений относительно воздействий солнечной радиации, пыли, атмосферного давления, влажности и ветровых нагрузок не предъявляется.

КО-206 М является самоходной машиной на специальном шасси высокой проходимости с двумя ведущими мостами. Кабинное оперение и капот двигателя изготовлены из композитных материалов. Кабина снегопогрузчика имеет большую площадь остекления. Зеркала заднего вида обеспечивают хорошую обзорность. Подрессоренное и комфортное сиденье водителя регулируется по высоте и наклону спинки. Передняя панель черная матовая. Приборы спрятаны в отдельные колодца. Регулируемая рулевая колонка способствует удобному положению рук во время работы. Резиновые уплотнители двери удерживают тепло в салоне. Фары и дополнительные фонари освещения под козырьком крыши позволяют работать в темное время суток.

 

Технические характеристики
Колесная формула 4х4
Транспортная скорость 30
Расчетная производительность, т/ч 40
Двигатель Д-242Л, диз
Мощность, кВт (л.с) 45,6 (62)
Масса снаряженная, кг 6000
Ширина рабочей зоны снегоочистки, м. 2,6
Высота убираемого слоя 1,1
Высота погрузки, м. 3,8
Вылет транспортера, м. 2,5
Габариты в транспортном положении, мм 9900х2800х3300
Расход топлива, л/ч 10,5

Peugeot 206 – обзор, цены, видео, технические характеристики

Дебют модели Peugeot 206 состоялся в 1998 году. Автомобиль выпускается в двух вариантах кузова: трех- и пятидверный хэтчбек. Дизайн машины довольно агрессивен из-за раскосых фар, рельефных бамперов с черными накладками и динамичного, стремительного силуэта. Внутри машины довольно просторно, а салон сконструирован таким образом, что в нем можно перевезти груз длинной до 2,2 метра. В 2001 году была показана модель Peugeot 206 State Wagon, внешний вид которой придавал ей характер спорткара. Увеличенная на 19 сантиметров длина позволила разработчикам поработать и над багажным отсеком он стал на 28% больше, чем багажник предыдущей версии. На крыше модели Peugeot 206 SW установлены рейлинги для перевозки крупногабаритного груза. Техническая часть автомобиля повторяет характеристики хэтчбека. В 2003 году машина получила новый двигатель и трансмиссию, а также боковые шторки безопасности. В этом же году дебютировала заряженная версия хэтчбека 206 RC, максимальная скорость которой составляет 220 км/час. На Франкфуртском автосалоне в 2005 году производитель представил модель Peugeot 206 Sedan. Производство машины в этом кузове налажено в Тегеране на заводе одного из промышленных партнеров компании Peugeot. В Россию она поставляется под другим иранским брендом Iran Khodro.

Автомобиль 206 CC является оригинальной разработкой французского производителя Peugeot. Машина выполнена в кузове купе-кабриолет и имеет складную металлическую крышу. Модель сконструирована на платформе хэтчбека 206. Главная особенность авто заключается в жесткой складной крыше – такой вариант верха устанавливался на данный класс европейских машин впервые. Дебют Peugeot 206 CC состоялся в 2000 году. Дизайн модели разрабатывался в итальянской студии Pininfarina. Емкость багажного отсека машины варьируется в переделах 175-400 литров в зависимости от положения крыши. На трансформацию автомобиля с помощью электропривода уходит 20 секунд. На российском рынке машина продавалась с 1,6-литровым двигателем, развивающим мощность в 110 лошадиных сил и работающим в паре с четырехступенчатой автоматической либо пятиступенчатой механической трансмиссией. В Европе машину продавали с 110-сильным и 135-сильным моторами. В интерьере салона могла использоваться тканевая или кожаная отделка. Производство Peugeot 206 CC было свернуто в 2007 году. За это время было продано около 360 тысяч экземпляров купе-кабриолета, что сделало его безоговорочным лидером в классе.

Технические характеристики Caterpillar 206. Колесный экскаватор.

9. Максимальная высота среза 6580 мм
10. Максимальная высота погрузки 4600 мм
11. Максимальный вылет вдоль уровня земли 7240 мм
13. Максимальная глубина копания 4440 мм
1. Транспортировочная длина блока 7380 мм
3. Транспортировочная высота блока 3109 мм
9. Максимальная высота среза 6680 мм
10. Максимальная высота погрузки 4770 мм
11. Максимальный вылет вдоль уровня земли 7720 мм
13. Максимальная глубина копания 4920 мм
9. Максимальная высота среза 6580 мм
10. Максимальная высота погрузки 4600 мм
11. Максимальный вылет вдоль уровня земли 8100 мм
13. Максимальная глубина копания 5510 мм
9. Максимальная высота среза 7700 мм
10. Максимальная высота погрузки 5870 мм
11. Максимальный вылет вдоль уровня земли 7570 мм
13. Максимальная глубина копания 4140 мм

фото, описание, история создания и характеристики

Популярная линейка моделей Cessna 205/206/207 началась с четырехместного аппарата общего назначения, являвшегося удлиненной версией модели 182 Skylane.

Исходной формой модели 205 (изначально 210-5) была модификация модели 210 Centurion, оптимизированная для хозяйственных нужд, с увеличенным багажным отсеком. Введенная в производство в 1962 году 205-я была снабжена таким же двигателем IO-470, как 210B и еще имела дополнительную маленькую грузовую дверцу на левой стороне фюзеляжа. Позже модель стала шестиместной.

Cessna 205 производилась до 1964 года, когда она было заменена более мощной 206, которая имела 2 модификации P206 Super Skylane и U206 Super Skywagon, что соответственно значило пассажирский и общего назначения. Производство их было прекращено в 1985.

Модель 207 Skywagon имела фюзеляж, удлиненный на 1.07 метра (стала семиместной) и производилась с 1969. Известная с 1978 года, как Stationair 7, она была заменена с 1979 года моделью 207А Stationair 8 (восьмиместной). Производство прекратилось в 1984 году.

Модель 206 – третья, производство которой возобновилось на новом независимом заводе компании в Канзасе. Существуют две версии – с нормальной подачей воздуха 206H и турбо T206H. Т206Н совершил первый полет 6 августа 1996 года, а 206Н 6 ноября того же года.

207A
максимальная скорость (км/ч): 278
максимальная крейсерская скорость (км/ч): 266
крейсерская скорость для дальних полетов (км/ч): 220
дальность полета со стандартным запасом топлива (км): 870
дальность полета с дополнительным запасом топлива (км): 1280

206H
максимальная скорость (км/ч): 278
крейсерская скорость при 75% мощности (км/ч): 265
длина взлетной полосы (м): 275

T206H
максимальная скорость (км/ч): 315
крейсерская скорость при 75% мощности (км/ч): 306
длина взлетной полосы (м): 255

206H и T206H
размах крыльев (м): 10,92
длина (м): 8,62
высота (м): 2,92
площадь крыла (кв.м.): 16,2

207A
все то же, кроме
длина (м): 9,68

207A
пустой (т): 0,951
максимальная взлетная (т): 1,639

206H
пустой (т): 0,974

T206H
пустой (т): 1,011

Технические характеристики Peugeot 206

Описание автомобиля Peugeot 206

Выпуск хэтчбеков Peugeot 206 осуществлялся с 1998 года, модель неоднократно подвергалась модернизации, сборка автомобиля прекратилась в 2007 году. Эта машина привлекает к себе внимание спортивным, стремительным обликом. Носовая часть имеет существенный угол наклона, на ней выделяются узкие росчерки фар, развитая воздухозаборная система, широкая декоративная накладка, переходящая на боковые плоскости корпуса.

Элементам внутреннего интерьера приданы закругленные формы, шкалы на приборном щитке и некоторые средства управления подчеркнуты хромированной окантовкой. Профиль посадочных мест образует уверенную, но ненавязчивую поддержку тела. Задний диван в случае необходимости трансформируется в грузовую площадку. Консоль насыщена оборудованием, в ее верхней части сформирована глубокая ниша, в которой установлены электронные часы. В состав базовых опций входит четыре подушки безопасности, полноценный комплект средств активной безопасности объединенных в единую, эффективную систему. Линейка силовых агрегатов состоит исключительно из бензиновых моторов, топовый обеспечивает время разгона до сотни за 12,5 секунды.  

Экстерьер

Капот и передние крылья Peugeot 206 имеют 40-градусный угол наклона, возле лобового стекла сформированы парные полосы дополнительных воздухозаборников. Блоки фронтального света обладают формой вытянутого овала установленного под 45-градусным углом. На широком переднем бампере образован воздухозаборник овальной формы, его верхнюю часть пересекает декоративная накладка, под бампером выполнен интегрированный аэродинамический обвес, над ним скомпонованы круглые габаритные огни. От передних арок колес отходит восходящее ребро жесткости, которое пересекает дверные ручки. Купол крыши на корме гармонично переходит в широкий спойлер, задние объемные фонари имитируют дизайн фар, на бампере присутствует декоративный обвес. Корпусу приданы габариты 3835/1673/1435 мм, размер передней колеи – 1437 мм, задней – 1428 мм. Высота дорожного просвета – 160 мм, диаметр полного разворота – 9,8 метров, объем багажника – 245 литров, это пространство расширяется до 1130 литров. Величина колесной базы – 2442 мм, полная масса – 1450 кг, снаряженная – 1025 кг.

Интерьер

Внутреннее пространство Peugeot 206 отделывается 2-цветными материалами, сиденья обтянуты тканевыми чехлами, стойки боковой поддержки оформлялись велюром или натуральной кожей. В двери интегрированы подлокотники, под ними имеются неглубокие карманы. По краям передней панели разнесены воздуховоды, с правой стороны панели располагается бардачок, изготовленный из светлого пластика. Из центра панели выступает «горб» консоли, в ее верхней части образована ниша, куда встроены электронные часы. Под ними располагаются воздуховоды, автомагнитола, блок управления климатическим оборудованием. Селектор трансмиссии установлен на металлизированной площадке, здесь же скомпонован рычаг ручного тормоза. Приборный щиток оборудован четырьмя шкалами, заключенными в хромированную окантовку.

Технические характеристики

Базовый агрегат развивает мощность до 75 л. сил, имеет рабочий объем 1360 см3, предельный крутящий момент – 120 Нм, максимальная скорость – 170 км/час, время разгона 12,8 секунды, расход горючего в смешанном цикле эксплуатации – 7 литров. Более продвинутая версия хэтчбека комплектуется 110-сильным мотором с рабочим объемом 1587 см3, крутящий момент – 147 Нм, динамика ускорения 12 секунд.       

Модификации и технические характеристики Peugeot 206

Технические характеристики Peugeot 206, Седан 1998-2010

Технические характеристики Peugeot 206, Хэтчбек 1998-2010

  • 206 1.1 i MT 3-door (60 Hp), Механика, 1124 куб.см., 60 л.с.
  • 206 1.1 i MT 5-door (60 Hp), Механика, 1124 куб.см., 60 л.с.
  • 206 1.4 HDi MT 3-door (68 Hp), Механика, 1398 куб.см., 68 л.с.
  • 206 1.4 HDi MT 5-door (68 Hp), Механика, 1398 куб.см., 68 л.с.
  • 206 1.4 i AT 3-door (75 Hp), Автомат, 1361 куб.см., 75 л.с.
  • 206 1.4 i AT 5-door (75 Hp), Автомат, 1361 куб.см., 75 л.с.
  • 206 1.4 i MT 3-door (75 Hp), Механика, 1361 куб.см., 75 л.с.
  • 206 1.4 i MT 5-door (75 Hp), Механика, 1361 куб.см., 75 л.с.
  • 206 1.6 16V MT 3-door (109 Hp), Механика, 1587 куб.см., 109 л.с.
  • 206 1.6 16V MT 5-door (109 Hp), Механика, 1587 куб.см., 109 л.с.
  • 206 1.6 i 16V AT 3-door (109 Hp), Автомат, 1587 куб.см., 109 л.с.
  • 206 1.6 i 16V AT 5-door (109 Hp), Автомат, 1587 куб.см., 109 л.с.
  • 206 1.6 i MT 3-door (88 Hp), Механика, 1587 куб.см., 88 л.с.
  • 206 1.6 i MT 5-door (88 Hp), Механика, 1587 куб.см., 88 л.с.
  • 206 1.9 D MT 3-door (68 Hp), Механика, 1868 куб.см., 68 л.с.
  • 206 1.9 D MT 5-door (68 Hp), Механика, 1868 куб.см., 68 л.с.
  • 206 2.0 HDI 90 MT 3-door (90 Hp), Механика, 1997 куб.см., 90 л.с.
  • 206 2.0 HDI 90 MT 5-door (90 Hp), Механика, 1997 куб.см., 90 л.с.
  • 206 2.0 i RC MT 3-door (177 Hp), Механика, 1997 куб.см., 177 л.с.
  • 206 2.0 S16 MT 3-door (135 Hp), Механика, 1997 куб.см., 135 л.с.
  • 206 2.0 S16 MT 5-door (135 Hp), Механика, 1997 куб.см., 135 л.с.

Технические характеристики Peugeot 206, Универсал 1998-2010

  • 206 SW 1,4 AT (75 Hp), Автомат, 1360 куб.см., 75 л.с.
  • 206 SW 1,4 MT (75 Hp), Механика, 1360 куб.см., 75 л.с.
  • 206 SW 1.1 MT (60 Hp), Механика, 1124 куб.см., 60 л.с.
  • 206 SW 1.4 HDi MT (68 Hp), Механика, 1398 куб.см., 68 л.с.
  • 206 SW 1.6 i 16V AT (110 Hp), Автомат, 1587 куб.см., 110 л.с.
  • 206 SW 1.6 i 16V MT (110 Hp), Механика, 1587 куб.см., 110 л.с.
  • 206 SW 2.0 GTi MT (136 Hp), Механика, 1997 куб.см., 136 л.с.
  • 206 SW 2.0 HDi MT (90 Hp), Механика, 1997 куб.см., 90 л.с.
  • 206 SW 2.0 HDi MT (90 Hp), Механика, 1997 куб.см., 90 л.с.

Технические характеристики Peugeot 206, Кабриолет 1998-2010

  • 206 CC 1.6 AT (109 Hp), Автомат, 1587 куб.см., 109 л.с.
  • 206 CC 1.6 HDI MT (109 Hp), Механика, 1560 куб.см., 109 л.с.
  • 206 CC 1.6 MT (109 Hp), Механика, 1587 куб.см., 109 л.с.
  • 206 CC 2.0 S16 MT (135 Hp), Механика, 1997 куб.см., 135 л.с.

б/у Peugeot 206

Все объявления

Новые Peugeot

Все объявления

Игровой обзор

EVGA GeForce RTX 2060 KO Ultra: победитель решением

Лучшие на сегодняшний день предложения EVGA GeForce RTX 2060 KO Ultra

На выставке CES 2020 EVGA анонсировала новый SKU в своей линейке на базе Nvidia Turing – RTX 2060 KO Gaming. Объявление совпало с выпуском AMD RX 5600 XT в конце того же месяца. В то время карта AMD позиционировала себя как прорывной продукт с ценой в 300 долларов, с целью обеспечить лучшую производительность, чем более дорогой RTX 2060, при меньших затратах. Это важный и горячо оспариваемый ценовой сегмент среди лучших видеокарт.EVGA сократила некоторые функции RTX 2060 KO, предложив базовые возможности подключения ввода-вывода и меньший радиатор, чтобы соответствовать цене 299,99 долларов – на 50 долларов меньше, чем стартовая цена Founder’s Edition RTX 2060 (которую Nvidia также упала до 299 долларов). .

Здесь мы рассмотрим EVGA RTX 2060 KO Ultra Gaming, который по-прежнему продается по агрессивной цене в 319,99 долларов, но имеет повышенную частоту ядра и лучшую производительность. По этой цене это все еще одна из самых дешевых моделей RTX 2060, и KO SKU от EVGA сделали упреждающий выстрел в AMD RX 5600 XT по цене от 279 долларов.99 до 339,99 долларов.

Производительность нашей игровой карты EVGA RTX 2060 KO Ultra Gaming соответствует нашим ожиданиям. То есть он быстрее, чем RTX 2060, медленнее, чем RTX 2060 Super (обе версии Founders Edition), и уступает более производительным вариантам RX 5600 XT. RTX 2060 KO Ultra – это очень способная карта 1080p, которая легко дает в среднем более 60 кадров в секунду во всех наших тестовых играх, за исключением Metro Exodus . При увеличении разрешения, но снижении до средних, мы получили аналогичные результаты с разрешением 1440p с EVGA RTX 2060 KO Ultra Gaming.

Ниже мы более подробно рассмотрим, как EVGA KO Ultra Gaming сочетается с Gigabyte RX 5600 XT Gaming OC 6G и другими сопоставимыми картами. Мы также проверим, насколько хорошо меньший кулер работает с кристаллом TU104, а также другие детали производительности.

(Изображение предоставлено EVGA)

Возможности

Как сообщалось ранее в январе, в нашей EVGA RTX 2060 KO Ultra Gaming используется графический процессор TU104, который обычно используется в RTX 2070 Super и RTX 2080/2080 Super, но он сокращен до соответствуют спецификациям RTX 2060 (как RTX 2060, так и 2060 Super обычно используют кремний TU106).Разумно предположить, что эти матрицы TU104-150 не подходят для карт более высокого класса, и здесь только 60% ядер CUDA и шесть из восьми каналов памяти должны быть «хорошими», чтобы работать как RTX 2060. Учитывая низкую цену обеих карт этой серии KO, вероятная причина использования этого кристалла для экономии средств RTX 2060 – у Nvidia, вероятно, есть запас микросхем TU104, которые не могут удовлетворить требования более дорогих моделей.

Странный выбор основного кремния здесь – интересный факт, но он имеет мало реальных последствий.Для игровых целей это просто RTX 2060. Однако, как показали другие сайты, при рендеринге в Blender карта работает лучше, чем ее тезка, находясь между RTX 2060 FE и RTX 2070 Super Founders Edition. Те, кто рассматривает эту карту для вычислительных задач, таких как Blender, могут задаться вопросом, есть ли способ узнать перед покупкой, какая матрица находится под капотом. Согласно электронному письму, которое мы получили от EVGA, ответ «нет». Однако представитель EVGA сообщил нам, что карта KO «… является и будет оставаться TU104 в обозримом будущем».В этом есть смысл, поскольку печатная плата физически отличается от обычной карты 2060. TU104 больше и имеет больше точек пайки, чем TU106, поэтому производители не могут использовать одну и ту же плату для обоих чипов.

Кристалл изготовлен с использованием 12-нм технологического процесса FinFET Nvidia (FFN) TSMC, который размещает 13,6 миллиарда транзисторов на площади 545 мм². RTX 2060 KO и KO Ultra имеют конфигурацию 30 SM по сравнению с 34 SM у RTX 2060 Super и 36 SM у RTX 2070. Это дает 1920 шейдеров, 48 блоков ROP и 120 блоков TMU. Поскольку архитектура Тьюринга масштабируется вместе с количеством SM, все основные вычислительные значения масштабируются вместе с ней.Это означает снижение на 17% количества ядер трассировки лучей, количества тензорных ядер, TMU и кеш-памяти L0 / L1.

Тактовые частоты KO Ultra Gaming установлены на уровне 1365 МГц с повышением до 1755 МГц. Последнее на 75 МГц выше эталонных частот (1365/1680 МГц соответственно), а увеличение тактовой частоты даст лучшую производительность, чем у карты с эталонной частотой. Что касается памяти, KO Ultra Gaming включает те же 6 ГБ памяти GDDR6 производства Samsung, которая находится на 192-битной шине.Скорость памяти 14 Гбит / с (1750 МГц) соответствует эталонной, как и большинство других карт от партнеров по плате. Эта конфигурация обеспечивает пропускную способность 336 Гбит / с.

EVGA RTX 2060 KO Ultra Gaming потребляет 160 Вт энергии. Это значение меньше 180 Вт AMD RX 5700 и больше 150 Вт RX 5600 XT. Фактическое энергопотребление будет зависеть от партнерских карт из-за более высоких тактовых частот и установки ограничения мощности. Питание к VRM осуществляется через один 8-контактный разъем PCIe.EVGA рекомендует блок питания мощностью не менее 500 Вт.

В следующей таблице приведены технические характеристики графических процессоров Nvidia и RTX 2060 KO Ultra Gaming:

EVGA RTX 2060 KO Ultra Gaming Nvidia RTX 2060 Nvidia RTX 2060 Super
Архитектура (GPU) Turing (TU104) Turing (TU106) Turing (TU10)
ALU / потоковые процессоры 1920 1920 2176
Пиковое вычисление FP32 (на основе типичного ускорения) 6.7 TFLOPS 6.5 TFLOPS 6.5 TFLOPS
Текстурные блоки 120 120 136
ROP 48 48 64
Nvidia Boost / AMD Game Rate 1755 МГц 1680 МГц 1650 МГц
Частота памяти 1750 МГц 1750 МГц 1750 МГц
Объем памяти 6 ГБ GDDR6 6 ГБ GDDR6 8 ГБ GDDR6
Шина памяти 192-бит 192-бит 256-бит
Пропускная способность памяти 336 ГБ / с 336 ГБ / с 448 ГБ / с
TDP 160 Вт 160 Вт 175 Вт
Счетчик транзисторов 13.6B 10,8B 10,8B
Размер матрицы 545 мм² 445 мм² 445 мм²

(Изображение предоставлено Tom’s Hardware)

Дизайн

EVGA RTX 2060 KO Ultra Gaming – это модифицированная на заводе двухслотовая видеокарта размером 7,9 x 4,3 x 1,5 дюйма (202,1 x 111,1 x 39,6 мм). Карта меньше, чем большинство полноразмерных графических процессоров, и находится заподлицо с верхней частью и платой ввода-вывода. Учитывая размер, эта карта должна уместиться во многих системах малого форм-фактора (SFF), а также в более крупных шасси.Обязательно проверьте пространство внутри вашего футляра перед покупкой.

Изображение 1 из 4

(Изображение предоставлено: EVGA) Изображение 2 из 4

(Изображение предоставлено: EVGA) Изображение 3 из 4

(Изображение предоставлено: EVGA) Изображение 4 из 4

(Изображение предоставлено EVGA)

В охлаждающем решении EVGA используются два 85-мм вентилятора, которые предназначены для охлаждения всех критически важных компонентов, включая графический процессор, видеопамять и полевые МОП-транзисторы. Графический процессор контактирует с медной пластиной и двумя медными тепловыми трубками, которые отводят тепло от ядра. Память и полевые МОП-транзисторы охлаждаются благодаря толстым термопрокладкам, которые соприкасаются с ребрами.Фактически, компания удвоила тепловые прокладки на трех микросхемах памяти. Использование таких толстых термопрокладок – не самый эффективный способ отвода тепла от этих компонентов, и значительная его часть переместится в печатную плату. Задняя панель выполняет функции защиты, а также использует термопрокладки для отвода тепла от микросхем памяти.

(Изображение предоставлено Tom’s Hardware)

По сравнению с более дорогими моделями RTX 2060, меньший радиатор использует меньше тепловых трубок, что, вероятно, также способствует сокращению затрат.Позже мы обнаружим, что, хотя он был эффективным для охлаждения критически важных компонентов во время тестирования, шум вентилятора был выше, чем у конкурентов. EVGA решила не включать RGB-освещение, что также помогает компании снизить цену.

(Изображение предоставлено Tom’s Hardware)

RTX 2060 KO Ultra Gaming передает питание на графический процессор и память через 4 + 2-фазный VRM. Управление подачей питания осуществляется четырехканальным контроллером ON Semiconductor NCP81611. Обработкой памяти занимается контроллер UPI uP1666Q.Питание на плату осуществляется через один 8-контактный разъем PCIe. Теоретически эта конфигурация обеспечивает мощность до 225 Вт, что значительно превышает предел мощности в 160 Вт, что дает карте достаточно мощности для стандартного и разогнанного использования.

(Изображение предоставлено EVGA)

Карта EVGA имеет минимальные параметры вывода видео, по одному для DVI-D, HDMI и DisplayPort. Сравните это с эталонным RTX 2060 с двумя портами DisplayPort, одним HDMI и DVI-D, а также портом VirtualLink USB Type-C, и вы увидите еще одну область, где EVGA срезает углы, чтобы сэкономить деньги.Тем не менее, трех портов здесь должно хватить для большинства геймеров.

Как мы тестировали EVGA RTX 2060 KO Ultra Gaming

Наша текущая система тестирования видеокарт состоит из Intel Core i9-9900K, 8-ядерного / 16-поточного процессора, который обычно считается самым быстрым игровым процессором в целом. Материнская плата MSI MEG Z390 Ace удерживает крепость благодаря 2×16 ГБ памяти Corsair Vengeance Pro RGB DDR4-3200 CL16 (CMK32GX4M2B3200C16). Для охлаждения процессора используется моноблок Corsair h250i Pro RGB AIO вместе со 120-миллиметровым вентилятором Sharkoon для общего воздушного потока через тестовую систему.Наша операционная система и игровой комплект хранятся на одном жестком диске Kingston KC2000 NVMe PCIe 3.0 x4 емкостью 2 ТБ.

На материнской плате установлена ​​версия BIOS 7B12v16. Оптимизированные значения по умолчанию использовались для настройки системы. Затем мы включили профиль XMP памяти, чтобы заставить память работать с номинальной частотой 3200 МГц CL16. Никаких других изменений BIOS или улучшений производительности не было. Используется последняя версия Windows 10 (1909), которая полностью обновлена ​​по состоянию на февраль 2020 года.

Наша иерархия графических процессоров дает полный обзор видеокарт и того, как различные модели сочетаются друг с другом.Для этих отдельных сторонних обзоров карт мы включаем графические процессоры, которые конкурируют с рассматриваемой картой и по производительности близки к ней. Что касается AMD, это Gigabyte RX 5600 XT Gaming OC и эталонная Radeon RX 5700. Для Nvidia мы включили EVGA GTX 1660 Ti XC, RTX 2060 Founders Edition и RTX 2060 Super Founders Edition для сравнения.

В нашем списке тестовых игр сейчас Tom Clancy’s The Division 2 , Ghost Recon: Breakpoint , Borderlands 3 , Gears of War 5 , Strange Brigade , Shadow of the Tomb Raider , Far Cry 5 , Metro Exodus , Final Fantasy XIV: Shadowbringers , Forza Horizon 4 и Battlefield V. Эти названия представляют широкий спектр жанров и API, что дает нам хорошее представление о различиях в производительности между картами. Мы используем сборку драйвера 441.20 для карт Nvidia и Adrenalin 2020 Edition 19.12.2 для карт AMD, хотя 5600 XT был протестирован с использованием бета-драйверов 20.1.2.

Мы фиксируем наши кадры в секунду (fps) и информацию о времени кадра, запуская OCAT во время наших тестов. Для определения тактовой частоты и скорости вращения вентилятора, температуры и мощности мы используем возможности записи журнала GPU-Z.В ближайшем будущем мы возобновим использование системы на основе Powenetics из предыдущих обзоров.

БОЛЬШЕ: Лучшие видеокарты

БОЛЬШЕ: Таблица иерархии производительности графических процессоров для настольных ПК

БОЛЬШЕ: Все графическое содержимое

Идентификация белков TMEM206 как поры чувствительных к кислоте хлоридных каналов PAORAC / ASOR

За исключением полухордового TMEM206, который демонстрирует заметную дивергенцию последовательностей и сохраняется в ER, все протестированные белки TMEM206 давали сильно выпрямляющие наружу токи Cl , которые были активированы внеклеточным подкислением при превышении ~ pH -6.Сильное выпрямление может быть физиологически несущественным, поскольку все ортологи давали токи также при отрицательных напряжениях и потому что положительные внутренние напряжения редко достигаются in vivo, особенно в невозбудимых клетках. Напротив, консервативная активация кислотным pH o кажется решающей и ставит вопрос, где и когда можно достичь таких значений pH. ASOR млекопитающих требует немного менее кислого pH для активации при физиологических температурах (37 ° C) (Sato-Numata et al., 2013; Sato-Numata et al., 2014), но это соображение кажется несущественным для ортологов рептилий и рыб.

Лишь некоторые типы клеток в организме млекопитающих физиологически подвергаются воздействию внеклеточного pH, более кислого, чем pH 6,0. К ним относятся клетки желудка и двенадцатиперстной кишки, мозгового собирательного канала почек (Bengele et al., 1983), а также секретирующие кислоту остеокласты и макрофаги (Silver et al., 1988), но неясно, экспрессируется ли ASOR в соответствующих мембранах эти поляризованные клетки. Более того, маловероятно, что важная функция в небольшом подмножестве клеток привела к почти повсеместной экспрессии ASOR во время эволюции.С другой стороны, внутриклеточные компартменты, такие как эндосомы и лизосомы, которые могут быть подкислены до pH 4,5, могут обеспечить идеальную среду для активности ASOR. Здесь ASOR может способствовать закислению просвета за счет шунтирующих потоков протон-АТФазы, как описано для эндосомных транспортеров CLC Cl (Günther et al., 1998; Jentsch, 2007; Piwon et al., 2000). Интересно, что везикулярные CLC также демонстрируют сильную внешнюю ректификацию, но в отличие от ASOR это 2Cl / H + -обменники, которые ингибируются люминальным (или внеклеточным) закислением (Jentsch, 2007; Jentsch and Pusch, 2018; Scheel et al. ., 2005). Следовательно, присутствие как ASOR, так и CLCs на эндолизосомах может обеспечивать дифференциальную регуляцию напряжения везикулярной мембраны и концентрации ионов. Однако считается, что ClC-7 является основным переносчиком лизосом Cl (Graves et al., 2008; Kornak et al., 2001), и иммуноцитохимия показала выраженную экспрессию плазматической мембраны у всех исследованных ортологов ASOR позвоночных. Хотя вариабельная цитоплазматическая мечение, наблюдаемая при сверхэкспрессии TMEM206, могла быть результатом сверхэкспрессии и не показала очевидной совместной локализации с лизосомальной маркерной лампой-1 в предварительных экспериментах, мы полагаем, что более тщательное исследование дополнительной локализации ASOR во внутриклеточных компартментах может быть оправдано.

Размышляя о биологической роли ASOR, поучительно сравнить его с кислотно-чувствительными каналами ASIC (Waldmann et al., 1997; Wemmie et al., 2013). Помимо катионных каналов, ASIC отличаются от ASOR большим молекулярным разнообразием (четыре разные субъединицы могут собираться в различные гомо- и гетеротримеры), быстрой инактивацией и степенью чувствительности к pH. В зависимости от изоформы их pH 50 для активации находится в диапазоне от ~ 4,8 до ~ 6,6 (Gründer and Pusch, 2015; Wemmie et al., 2013), значения, которые более чем на 1 единицу pH более щелочные, чем у ASOR (pH 50 ~ 5,3). Следовательно, некоторые физиологические функции ASIC вряд ли будут иметь эквиваленты ASOR. Например, постсинаптические ASIC могут усиливать возбуждающую синаптическую передачу, открываясь в ответ на падение pH в синаптической щели, вызванное экзоцитозом кислотного содержимого синаптических пузырьков (Chu and Xiong, 2012; Gründer and Pusch, 2015; Huang et al. др., 2015). Даже если ASOR будет экспрессироваться постсинаптически, предполагаемое падение pH o (Gründer and Pusch, 2015) кажется слишком малым для его активации.ASIC также играют роль в ощущении периферической боли (Waldmann et al., 1997; Wemmie et al., 2013). Если она экспрессируется на соответствующих сенсорных нейронах, такая функция возможна также для ASOR, потому что высокая внутриклеточная концентрация Cl в периферических нейронах может позволить деполяризующий Cl -отток (Funk et al., 2008). Поразительно, но голые землекопы нечувствительны к боли, вызванной кислотой, но их каналы ASIC показывают нормальную чувствительность к pH (Smith et al., 2011). Мы также обнаружили, что каналы TMEM206 / ASOR этого вида обладают нормальной чувствительностью к pH.Нечувствительность к pH землекопов может быть скорее связана с измененной чувствительностью к pH канала Na + Na v 1,7 (Eigenbrod et al., 2019; Smith et al., 2011).

Следует отметить, что каналы ASIC участвуют в различных неврологических патологиях, связанных с кислым pH (Huang et al., 2015; Wemmie et al., 2013), включая инсульт (Xiong et al., 2004) и рассеянный склероз. (Friese et al., 2007). Аналогичным образом, основываясь на защитных эффектах неспецифических ингибиторов ASOR, Окада и его коллеги предположили, что ASOR играет роль в индуцированной кислотой гибели эпителиальных клеток (Wang et al., 2007) и нейроны (Sato-Numata et al., 2014). Используя клетки TMEM206, , – / – , мы теперь установили, что генетическая абляция каналов TMEM206 / ASOR частично защищает клетки от гибели клеток, спровоцированной сильнокислым pH o (4.5). Интересно, что по сравнению с мышами корковые нейроны голых землекопов устойчивы к индуцированной кислотой гибели клеток (при pH 5,0) (Husson and Smith, 2018). Поскольку ни pH-реакция ASIC (Smith et al., 2011), ни ASOR (эта работа) не изменяется у этих видов, объяснение этой устойчивости может быть связано с уровнями экспрессии каналов или другими факторами.

Было высказано предположение (Wang et al., 2007), что ASOR-зависимая кислотно-индуцированная гибель клеток является результатом устойчивого набухания клеток, обусловленного параллельным притоком Na + и Cl через активируемые кислотой ASIC и ASOR. каналы соответственно. В то время как в наших экспериментах клетки WT первоначально набухали быстрее, чем клетки TMEM206 – / – , впоследствии они восстанавливали свой объем и даже уменьшались. Первоначальное набухание действительно может быть связано с открытием как ASIC, так и ASOR, при этом ASIC-опосредованный приток Na + опосредует деполяризацию, необходимую для пассивного притока Cl .Однако, в отличие от ASOR, каналы ASIC инактивируются (Gründer and Pusch, 2015), что приводит к изменению электрохимического потенциала Cl , пассивному оттоку Cl через ASOR и последующему осмотическому сжатию клеток. Хотя в настоящее время мало сомнений в том, что каналы TMEM206 / ASOR способствуют индуцированной кислотой гибели клеток, лежащий в основе каскад передачи сигналов, вероятно, сложен.

Недавно, когда эта работа была завершена, Ян и др. сообщили об их независимой идентификации и характеристике TMEM206 как неотъемлемого компонента канала ASOR (который авторы переименовали в PAC для P, ротон- A , активированный канал C ) (Yang et al., 2019). Они также сообщили о защитных эффектах разрушения TMEM206 на индуцированную кислотой гибель клеток НЕК или культивируемых первичных кортикальных нейронов. Интересно, что эти авторы показали, что Tmem206 – / – мышей показали меньшие области инсульта в модели окклюзии средней мозговой артерии (Yang et al., 2019), хотя ранее сообщалось о снижении pH с до в области инсульта ( до ~ 6.4) (Nedergaard et al., 1991) немного выше значения, необходимого для активации ASOR.При сканировании модификации цистеина, ограниченном внеклеточной половиной TM2, они также обнаружили, что реакция I307C с MTSES снижает токи ASOR, и показали, что мутант I307A демонстрирует умеренно пониженную проницаемость для йода. Эти результаты согласуются с нашим выводом о том, что весь TM2 и внеклеточный конец поры ASOR линии TM1 образуют олигомерный комплекс.

Метаболические характеристики субпопуляций CD8 + Т-клеток у молодых и пожилых людей не позволяют прогнозировать функциональность

T

VM , а клетки старых мышей обладают повышенной резервной дыхательной способностью

Мы стремились понять, является ли базальный метаболический фенотип T VM Клетки более тесно связаны с популяцией T N или имеют общие характеристики с обычными клетками T MEM , такие как повышенная митохондриальная нагрузка и SRC, а также для понимания того, как эти профили меняются с возрастом.Поэтому мы провели комплексный митохондриальный и метаболический анализ для каждой из этих подгрупп, выделенных из селезенки наивных молодых и старых мышей, свободных от специфических патогенов (SPF).

Базальный митохондриальный метаболический профиль подмножеств Т-клеток молодых и старых мышей CD8 + был определен путем проведения мито-стрессового теста с использованием биоанализатора Seahorse XFe96 на отсортированном T N (CD44 lo ), T VM (CD44 hi CD49d lo ) и T MEM (CD44 hi CD49d hi ) CD8 + клетки непосредственно ex vivo.В этом анализе скорость потребления кислорода (OCR) отслеживается в базальном состоянии (OCR Bas ), а затем во время лечения различными ингибиторами митохондрий, чтобы обеспечить измерение максимального OCR (OCR Max ), с разницей между OCR . Bas и OCR Max , представляющие SRC. Клетки T N от молодых и старых мышей имели сопоставимые профили OCR, что приводило к сопоставимым SRC для этих подмножеств (рис. 1a, b). Клетки T VM от молодых мышей имели значительно более высокий OCR, чем клетки T N , как при OCR Bas , так и, что более заметно, при OCR Max , что приводило к значительному увеличению SRC (рис.1а, б), что соответствует фенотипу памяти. Клетки T VM от старых мышей также имели стабильно более высокий OCR, чем клетки от молодых мышей, что приводило к значительно более высокому SRC (рис. 1a, b). Поразительно, что клетки T MEM от молодых мышей не демонстрировали более высокий SRC, чем клетки T N , а скорее имели самый низкий SRC из всех подмножеств (рис. 1a, b), в отличие от предыдущих отчетов 4 . В то время как значительное увеличение SRC также наблюдалось в клетках T MEM с возрастом (рис.1а, б), он оставался значительно ниже, чем SRC, наблюдаемый для клеток Т VM от старых мышей. Эти данные предполагают, что высокий SRC не является отличительной чертой клеток T MEM , а вместо этого определяет клетки T VM , и что старение вызывает увеличение SRC во всех Т-клетках с фенотипом памяти CD8 + .

Рис. 1: Клетки T VM имеют высокий SRC и CIV, который увеличивается с возрастом.

a Скорость потребления кислорода (OCR) во времени для отсортированных клеток T N , T VM и T MEM из селезенки наивных молодых и старых мышей SPF.Стрелки указывают на добавление митохондриальных ингибиторов (олигомицин; FCCP; антимицин A / ротенон) или временные точки для оценки SRC (OCR Bas , OCR Max ) ( n = 2–4, 5 экспериментальных повторностей). b Изменение OCR с OCR Bas на OCR Max (SRC) для каждого отсортированного подмножества ( n = 2–4, 5 экспериментальных повторов). c Электронно-микроскопические изображения отсортированных клеток непосредственно ex vivo, масштабная линейка показывает 0,2 мкм (1 экспериментальная повторность). d Конфокальная микроскопия отсортированных клеток непосредственно ex vivo, зеленая флуоресценция – окрашивание цитохромом C, масштабная линейка указывает 2 мкм, что было использовано для определения ( e ) преобладающей морфологии митохондрий (слитых, промежуточных или фрагментированных) для 140 клеток на subset и f средний митохондриальный след на клетку, рассчитанный из конфокальных изображений (3 экспериментальных повтора). г BN-PAGE и блот для Cox5a из ETC CIV, с указанием полос для CIV, CII, CIII 2 , CV и суперкомплекса CI / CIII 2 / CIV вместе с блотом, окрашенным Кумасси (3 экспериментальных повтора) . ч Скорость потребления кислорода (OCR) во времени для отсортированных клеток T VM от молодых мышей с высокой (200 мкМ) или низкой (5 мкМ) дозой этомоксира ( n = 3, 3 экспериментальных повтора). Показано среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM). NS указывает на незначительность, * указывает на p ≤ 0,05, ** указывает на p ≤ 0,01, непарный тест t .

Корреляция характеристик митохондрий SRC

Часто считается, что увеличение SRC отражает количественные и / или качественные изменения в самих митохондриях, включая (i) более плотные митохондриальные кристы, способствующие процессивности и эффективности потребления кислорода цепью переноса электронов (ETC) 3 , (ii) слитная морфология митохондрий 6 и (iii) повышенная митохондриальная нагрузка или объем 5 .Для оценки этих митохондриальных характеристик клетки T N , T VM и T MEM от молодых и старых мышей были отсортированы, и митохондрии были визуализированы непосредственно ex vivo. По данным электронной микроскопии, не было очевидных различий в размере, плотности или морфологии митохондриальных крист между типами клеток или возрастом (рис. 1c). Когда слияние митохондрий оценивали с помощью конфокальной микроскопии (рис. 1d), промежуточная или слитая морфология наблюдалась только в меньшинстве клеток, даже для клеток T MEM (рис.1e), предполагая, что слияние митохондрий не требуется для поддержания клеток T MEM . Кроме того, не наблюдались клетки T VM от молодых мышей со слитой морфологией (рис. 1e), несмотря на их высокий SRC. Поразительно, что с возрастом происходило существенное увеличение митохондриального слияния во всех типах клеток, причем этот эффект наиболее очевиден в клетках T VM (Fig. 1e). Наконец, митохондриальный след на клетку как показатель митохондриальной нагрузки был самым высоким в клетках T VM и T MEM и значительно увеличивался с возрастом в клетках T N и T VM (рис.1е).

Как правило, морфология, слияние или объем митохондриальных крист плохо коррелировали с высоким SRC, избирательно наблюдаемым в субпопуляции клеток T VM . Чтобы получить более прямую оценку емкости электронной транспортной цепи (ETC), уровни митохондриального ETC Complex IV (CIV; Cox5a) из определенного количества каждой клеточной субпопуляции количественно определяли непосредственно с помощью синего PAGE и иммуноблоттинга. Хотя это не абсолютная корреляция, количество CIV, по-видимому, лучше коррелирует с SRC, чем с митохондриальной нагрузкой или морфологией; а именно CIV был увеличен в клетках T VM по сравнению с клетками T N от молодых мышей, и возрастное увеличение CIV было наиболее заметно в популяции T VM (рис.1г). В совокупности наши анализы митохондриальной нагрузки и морфологии показали, что они в целом позволяют прогнозировать возрастное увеличение SRC. Уровни экспрессии ETC CIV, по-видимому, наиболее точно предсказывают клеточный SRC в зависимости от возраста и подгрупп.

Чтобы обеспечить механистическую основу для увеличения митохондриальной нагрузки / активности в клетках T VM от старых мышей, данные RNA-Seq, ранее полученные из субпопуляций T N , T VM и T MEM от молодых и старых мышей 17 опрашивали на предмет транскриптов, участвующих в митохондриальном биогенезе, митофагии и митохондриальном слиянии или делении.Во всех подмножествах Т-клеток наблюдалось зависящее от возраста снижение транскриптов Atg101 и Ulk1 , которые являются критическими для митофагии (дополнительный рис. 1a). Отмечалось соответствующее увеличение количества транскриптов PGC-1α ( Ppargcla ) с возрастом в популяциях обоих фенотипов памяти, что особенно заметно в подмножестве T VM (дополнительный рис. 1a). Анализ уровней транскриптов, связанных со слиянием митохондрий ( Mfn1 , Mfn2 , Opa1 ) или делением ( Dnm1l ), выявил минимальные изменения или их отсутствие среди субпопуляций Т-клеток или со старением (дополнительный рис.1в). В совокупности, хотя для истинного определения влияния митохондриальной динамики на митохондриальную нагрузку требуется более подробный биохимический анализ, эти транскрипционные данные подчеркивают, что с возрастом может наблюдаться уменьшение деградации митохондрий и увеличение биогенеза, особенно в подмножестве T VM , что может способствовать наблюдаемому увеличению митохондриальной нагрузки и SRC.

Нет доказательств того, что ФАО способствует высокому SRC в клетках T

VM

Ранее считалось, что высокий SRC в T клетках MEM подпитывается окислением жирных кислот (FAO), механизмом, в значительной степени определенным с использованием этогооксира для ингибирования карнитин-пальмитоилтрансферазы I. (Cpt1), который является ферментом, ограничивающим скорость для FAO 3 .Однако недавно было продемонстрировано, что высокая концентрация этаоксира, использованная в этих исследованиях, также ингибировала другие компоненты OXPHOS, снижая SRC 26,27,28 . Чтобы изучить влияние этогооксира на высокий уровень SRC в клетках T VM , препарат был включен в тест Mito Stress с клетками T VM молодых мышей либо в высокой концентрации (200 мкМ), либо в низкой концентрации (5 мкМ). , последний из которых, как предполагается, сохраняет специфичность для Cpt1 (ref. 27 ).Существенное снижение OCR Max наблюдалось при высокой концентрации этомоксира, но было только очень умеренное снижение OCR Max при низкой концентрации (рис. 1h). Это предполагает, что FAO через Cpt1 не способствует высокому SRC, наблюдаемому в клетках T VM .

Затем мы исследовали возможность того, что гликолиз необходим для подпитки высокого SRC, наблюдаемого в клетках T VM , скорее всего, за счет продукции пирувата 29 .Тест Mito Stress проводили на клетках T VM от наивных мышей с добавлением 2-дезокси-D-глюкозы (2-DG), аналога глюкозы, который ингибирует гликолиз. Добавление 2-DG имело минимальный эффект на OCR (дополнительный рис. 2a), аналогично добавлению низких доз этогооксира (рис. 1h). Напротив, добавление 2-DG резко снижает ECAR, подтверждая его эффективное ингибирование гликолиза (дополнительный рис. 2b). Эти данные предполагают, что высокий базальный SRC, наблюдаемый в клетках T VM , не зависит исключительно от ФАО или гликолиза, но может подпитываться субстратом, генерируемым независимо от обоих путей.

Вирусная инфекция приводит к увеличению SRC в клетках T

VM

Высокий SRC не наблюдался в клетках T MEM в этом исследовании (рис. 1a, b), но эти клетки T MEM были выделены из наивного SPF мышей и, вероятно, были созданы в ответ на комменсальные или низкопатогенные организмы и в условиях слабого воспаления. Чтобы оценить SRC в вызванных инфекцией клетках T MEM , мышей инфицировали вирусом гриппа A (IAV) и клетками T MEM , специфичными для тетрамерного H-2D b , нагруженных NP 366 , PA 224 и PB1-F2 62 эпитопа (клетки T MEM (IAV)) были выделены 20 дней спустя.Клетки T MEM и T MEM (IAV) показали одинаково низкий SRC (рис. 2a, b). Интересно, что клетки T MEM (IAV) постоянно демонстрировали значительно более высокие базальные и максимальные скорости внеклеточного закисления (ECAR Bas и ECAR Max ) по сравнению с клетками T N и T MEM (фиг. 2c). Эти данные показывают, что клетки T MEM и T MEM (IAV) метаболически различаются в отношении гликолитической, но не OXPHOS, способности.

Рис. 2: Клетки T VM увеличивают SRC при недавней инфекции.

a OCR для отсортированных клеток T N и T MEM из селезенки неинфицированных молодых мышей SPF или клеток Tetramer + T MEM (IAV) от мышей, инфицированных IAV (20 дней после заражения) и b изменение OCR для каждого отсортированного подмножества ( n = 4–2, 3 экспериментальных повтора). c ECAR для отсортированных клеток T N и T MEM от молодых неинфицированных мышей или клеток Tetramer + T MEM (IAV) от инфицированных IAV мышей (20 дней после заражения) с ECAR Bas и ECAR Max указаны ( n = 2–4, 3 экспериментальных повтора). d OCR для отсортированных клеток T N и T VM от молодых неинфицированных мышей или клеток T VM (IAV) от IAV-инфицированных мышей (20 дней после заражения) и e изменение OCR для каждой отсортированной подмножество ( n = 4–5, 3 экспериментальных повтора). f ECAR для отсортированных клеток T N и T VM от молодых неинфицированных мышей или мышей, инфицированных IAV (20 дней после заражения) ( n = 5, 3 экспериментальных повтора). Показано среднее значение ± стандартная ошибка среднего.NS указывает на незначительность, * указывает на p ≤ 0,05, ** указывает на p ≤ 0,01, непарный тест t .

Поразительно, недавняя инфекция IAV вызвала существенное повышение SRC клеток T VM (рис. 2d, e) без какого-либо изменения гликолитической способности (рис. 2f). Эти данные демонстрируют, что инфекция, как и старение, приводит к созданию среды, которая избирательно увеличивает SRC в клетках T VM (и, таким образом, антиген-независимым образом), и подтверждают, что высокий SRC не является каноническим признаком клеток T MEM . , даже вызванные инфекцией.

Традиционно определенные клетки T

CM – это преимущественно клетки T VM

Недавно было показано, что высокий SRC преимущественно разделяется с подмножеством долгоживущей центральной памяти (T CM ; CD44 hi CD62L hi ). T MEM , а не короткоживущей эффекторной памяти (T EM ; CD44 hi CD62L lo ) клеток 7 . В этом исследовании клетки T CM , по-видимому, были определены как CD44 hi CD62L hi CD8 + Т-клетки, полученные от мышей после инфицирования вирусом острого лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), которые будут включать клетки T VM . 20 .Чтобы определить степень, в которой метаболические характеристики клеток T CM были объединены с характеристиками клеток T VM , мы оценили долю классически определенных клеток T CM (CD44 hi CD62L hi ), которые были фактически клетки T VM (CD44 hi CD62L hi CD49d lo ) у наивных молодых, наивных старых мышей или мышей, инфицированных LCMV. У молодых и старых наивных мышей подавляющее большинство (≥85%) клеток T CM оказались клетками CD49d lo и, следовательно, клетками T VM (рис.3а). Даже через 40 дней после острой инфекции LCMV, которая вызывает значительный ответ Т-лимфоцитов CD8 + и создает устойчивые антиген-специфические популяции памяти 30 , более 60% клеток T CM оказались клетками T VM ( Рис. 3а). Это подчеркивает возможность того, что популяции Т-клеток CD8 + , ранее определенные как клетки T CM , от молодых, старых или инфицированных мышей, могли преимущественно состоять из клеток T VM .

Фиг.3: Клетки T VM составляют большую часть популяции клеток CD44 hi CD62L hi T CM .

a Гистограммы экспрессии CD49d на CD44 hi CD62L hi CD8 + Т-клетки (T CM клетки) от наивных молодых мышей, мышей наивного возраста и молодых мышей после заражения LCMV (40 дней после инфекция), с гистограммами, показывающими долю клеток T CM , которые являются клетками T VM ( n = 4–5). b Наложения CD44 hi CD49d lo T VM клетки на всем CD8 + Т-клетки с T EM / T CM гейтинг клеток (CD44 hi CD62L lo и CD62L lo и привет CD62L привет соответственно). c Наложение CD44 hi CD49d hi T MEM клеток на общее количество CD8 + Т-клеток. d Репрезентативные точечные диаграммы, идентифицирующие IAV-специфический тетрамер + CD8 + Т-клетки, которые представляют собой CD62L hi (T CM клетки) или CD62L lo (T EM клетки) (60 дней после инфицирования). ), с гистограммами средней частоты тетрамера + CD8 + Т-клеток, которые находятся в каждой подгруппе ( n = 5). e OCR для отсортированных клеток T N и T VM от молодых неинфицированных мышей и отсортированных клеток T CM и T EM от мышей, инфицированных LCMV (60 дней после заражения) и f изменение OCR для каждого отсортированного подмножества ( n = 5–6, 3 экспериментальных повтора). Данные из a d являются репрезентативными по крайней мере для двух отдельных экспериментов. Показано среднее значение ± стандартная ошибка среднего. * обозначает p ≤ 0,05, ** обозначает p ≤ 0.01, непарный т проба.

Реципрокный анализ также был выполнен для определения распределения отсортированных клеток T VM (CD44 hi CD49d lo ) и T MEM (CD44 hi CD49d hi ) от наивных молодых, наивных пожилых людей. или инфицированных LCMV мышей через классические ворота T CM (CD44 hi CD62L hi ) и эффекторную память (T EM ; CD44 hi CD62L lo ). Когда клетки T VM накладывались на графики CD44 / CD62L, они распределялись преимущественно по воротам T CM (~ 80%; рис.3б). Клетки T MEM преимущественно распределялись по воротам T EM (49-95%; рис. 3c), хотя значительная часть была обнаружена в воротах T CM у наивных молодых мышей. Мы также обнаружили, что клетки T MEM (IAV) были преимущественно клетками T EM (88,93 ± 6,67%) с некоторыми клетками T CM (11,07 ± 6,67%) (рис. 3d).

Чтобы окончательно определить относительный SRC клеток T CM и T EM наряду с клетками T VM , мы провели тест на стресс мито морского конька на клетках T N и T VM , выделенных от наивных мышей SPF и Клетки T EM и T CM , выделенные от мышей, инфицированных LCMV, через 60 дней после инфицирования.Как наблюдалось ранее, клетки T VM имели значительно более высокий SRC, чем все другие подмножества (рис. 3e, f). Кроме того, мы обнаружили, что клетки T EM имели значительно более низкий SRC, чем все другие подмножества, а клетки T CM имели умеренно более высокий SRC, чем клетки T N (рис. 3e, f). Это всесторонне демонстрирует, что высокий SRC не является определяющим признаком обычных ячеек T MEM , в частности подмножества ячеек T EM , а вместо этого является характеристикой ячеек T VM .

SRC коррелирует с маркерами выживаемости, а не функциональностью

Высокий SRC был предложен в качестве характеристики клеток T MEM , способствующей как их повышенной функциональности, так и долгосрочному выживанию 4,5 . Соответственно, мы стремились определить, коррелируют ли высокий SRC в клетках T VM и увеличение SRC с возрастом с улучшенной функциональностью CD8 + T-клеток или выживаемостью.

Тремя ключевыми функциями CD8 + Т-клеток во время иммунного ответа являются пролиферация, продукция цитокинов (особенно IFN-γ) и цитотоксичность.Недавно мы обнаружили, что клетки T VM от пожилых людей с самым высоким SRC обладают очень низкой TCR-управляемой пролиферативной способностью, хотя те немногие, которые могут отвечать, все еще продуцируют IFN-γ 17 . Для дальнейшей оценки функциональности субпопуляций CD8 + Т-клеток оценивали их цитотоксическую способность непосредственно ex vivo. Отсортированные клетки T N , T VM и T MEM от молодых и старых мышей OT-I использовали в анализе цитотоксичности in vitro с нагруженными овальбумином спленоцитами в качестве мишеней.У молодых мышей клетки T VM были значительно более цитотоксичными, чем клетки T N , и эквивалентны клеткам T MEM (фиг. 4a). С возрастом цитотоксичность клеток T N оставалась низкой, в то время как цитотоксичность клеток T VM и T MEM существенно снижалась (рис. 4а). Эти данные, наряду с нашей предыдущей работой 17 , демонстрируют, что клетки T VM и T MEM снижают цитотоксическую и пролиферативную способность с возрастом, несмотря на их увеличение SRC.

Рис. 4: SRC коррелирует с экспрессией Bcl-2, но не с функциональностью Т-клеток CD8 + .

a Процент лизиса мишеней, нагруженных OVA, отсортированными клетками T N , T VM и T MEM от молодых или старых мышей OT-I ( n = 3–8). * Означает p ≤ 0,05, ** указывает p ≤ 0,01, непарный тест t , данные являются репрезентативными по крайней мере для 3 отдельных экспериментов. Простой линейный регрессионный анализ среднего SRC из рис.1b против b – среднее число делений отсортированных CD8 + Т-клеток после 60-часовой стимуляции TCR из ссылки. 17 , c средний процент лизиса из ( a ), d средняя доля отсортированных CD8 + Т-клеток, продуцирующих IFN-γ через 36 часов после стимуляции TCR из ссылки. 17 и e – медианная интенсивность флуоресценции (MFI) экспрессии Bcl-2 из ссылки. 17 .

Чтобы формально проверить, коррелирует ли способность любой функции CD8 + Т-клеток (пролиферация, продукция цитокинов или цитотоксичность) с SRC, был проведен линейный регрессионный анализ по типам клеток и возрасту.Не наблюдалось значительной корреляции ни для одной из функций (рис. 4b – d), что всесторонне демонстрирует, что высокий SRC не обязательно указывает на усиление функции Т-клеток CD8 + , особенно в Т-клетках CD8 + от пожилых людей.

Наша предыдущая работа показала, что клетки Т VM от пожилых людей, которые демонстрируют самый высокий SRC, имели преимущество в выживаемости после адоптивного переноса 17 , который, по-видимому, параллельно экспрессировал антиапоптотический белок Bcl-2.Линейный регрессионный анализ экспрессии Bcl-2 по сравнению с SRC для разных типов клеток и возраста выявил значительную положительную корреляцию (рис. 4e), подчеркивая, что SRC связан с экспрессией Bcl-2 в качестве суррогата выживаемости в Т-клетках CD8 + .

Повышенный T

VM передача сигналов IL-15 увеличена SRC

Учитывая сильную корреляцию Bcl-2 с SRC, были оценены медиаторы экспрессии Bcl-2 для определения драйверов высокого SRC в клетках T VM с возраст.Цитокин, IL-15 (обзор в ссылке 31 ), был сильным кандидатом, поскольку было показано, что он способствует выживанию Т-клеток с фенотипом памяти CD8 + за счет индукции фосфорилирования STAT5 (pSTAT5) и экспрессии Bcl- 2 (исх. 32 ). Чтобы понять, как передача сигналов IL-15 может изменяться с возрастом в различных подгруппах, мы оценили экспрессию субъединиц цитокиновых рецепторов и передачу сигналов ниже по течению в клетках T N , T VM и T MEM от молодых и старых мышей.

Экспрессия IL-15Rβ была низкой на клетках T N , несколько выше на клетках T MEM и заметно и значительно выше на клетках T VM от молодых мышей (5-кратная, p <0,0001; Рис. 5а). Кроме того, в то время как ни T N , ни T MEM клетки не проявляли существенных возрастных изменений в экспрессии, клетки T VM демонстрировали заметное увеличение экспрессии IL-15Rβ с возрастом (фиг. 5a). Когда каждое подмножество было отсортировано и стимулировано растворимым IL-15, интенсивность pSTAT5 отслеживалась с уровнями экспрессии рецептора, с клетками T VM от молодых мышей, демонстрирующих высокий pSTAT5, который еще больше увеличивался с возрастом (рис.5б). Вместе эти данные показывают, что из всех подмножеств Т-клеток CD8 + клетки Т VM проявляют наибольшую чувствительность к передаче сигналов IL-15, и эта чувствительность увеличивается с возрастом.

Рис. 5: Высокая чувствительность к IL-15 в клетках T VM увеличивается с возрастом и опосредует увеличение SRC.

a IL-15Rβ MFI непосредственно ex vivo от отдельных мышей ( n = 5-7) или b pSTAT5 MFI после 15 минут стимуляции IL-15 in vitro на отсортированных T N , T Клетки VM и T MEM от молодых или старых мышей ( n = 3). c Репрезентативные точечные диаграммы для CD8 + Т-клеток, гейтированных по T N (CD44 lo ), T VM (CD44 hi CD49d lo ) и T MEM (CD44 hi ) CD49d hi ) клеток (указана частота CD8 + Т-клеток) и d частота CD8 + Т-клеток в каждой подгруппе у мышей WT или IL-15 KO ( n = 5 для WT и 7 для КО). e OCR для отсортированных T N , T VM и T MEM клеток от молодых неинфицированных, IAV-инфицированных и IAV-инфицированных / нейтрализующих IL-15 мышей, обработанных mAb, и f изменение OCR для каждого отсортированного подмножество.Показано среднее значение ± стандартная ошибка среднего. * Указывает на p ≤ 0,05, ** указывает на p ≤ 0,01, непарный тест t , данные для a , b , e , f являются репрезентативными по крайней мере для 3 отдельных экспериментов.

IL-15 считается критическим цитокином как для клеток T VM , так и для клеток T MEM , о чем свидетельствует тот факт, что мыши с нокаутом IL-15 (KO) теряют примерно половину своего фенотипа памяти (CD44 + ) клетки 33 и популяция клеток T VM не может развиваться у молодых мышей в отсутствие IL-15 или IL-15Rα 14,15 .Чтобы установить, отражает ли экспрессия IL-15Rβ и чувствительность к IL-15 субпопуляций CD8 + Т-клеток их относительную зависимость от IL-15, мы оценили развитие и устойчивость каждой подгруппы у молодых и старых мышей IL-15 KO. Клетки T VM отсутствовали у молодых мышей IL-15 KO, что согласуется с предыдущими исследованиями, а клетки T VM также отсутствовали у старых мышей (фиг. 5c, d). Следует отметить, что популяция клеток T MEM , по-видимому, остается относительно нетронутой у старых мышей (рис.5в, г). Это подчеркивает, что IL-15 абсолютно необходим для развития клеток T VM , но он незаменим для генерации и поддержания многих клеток T MEM у старых мышей.

IL-15 продуцируется на низких уровнях в устойчивом состоянии, но может резко повышаться в DC во время инфекции в ответ на передачу сигналов IFN типа I 34 . Чтобы проверить, приводит ли продукция IL-15 во время инфекции к наблюдаемому увеличению SRC в клетках T VM (рис.2d, e) мы вводили нейтрализующие IL-15 моноклональные антитела (mAb) молодым мышам, инфицированным IAV. MAb вводили на 0 и 3 дни после инфицирования, а SRC оценивали на 14 день. Прекращения передачи сигнала IL-15 во время инфекции было достаточно для отмены вызванного инфекцией увеличения SRC в клетках T VM (фиг. 5e, f). . В совокупности эти данные подчеркивают, что метаболический профиль и, в частности, повышенный уровень SRC, который ранее был связан с функцией и долголетием клеток T MEM , по-видимому, является прямой функцией воздействия IL-15 и не зависит от фенотипа T MEM .Кроме того, чувствительность клеток T VM к IL-15, по-видимому, объясняет высокий SRC, наблюдаемый в этих клетках непосредственно ex vivo от молодых мышей, и увеличение SRC в клетках T VM с возрастом.

Повышенный уровень IL-15Rβ и SRC в CD8 пожилого человека

+ Т-клетки

Чтобы определить, актуальны ли наши результаты на мышах для человека, мы сначала проанализировали экспрессию IL-15Rβ у молодых взрослых (20–30 лет) и старше. (60–80 лет) CD8 + Т-клетки человека. Мы обнаружили значительно более высокую экспрессию IL-15Rβ на клетках T VM по сравнению с клетками T N у молодых людей, и эта экспрессия значительно увеличивалась с возрастом во всех подгруппах (рис.6а, б), аналогично нашим наблюдениям на мышах. Более того, мы наблюдали тенденцию к увеличению SRC в общем количестве CD8 + Т-клеток с возрастом ( p = 0,1) (рис. 6c, d). Учитывая наше предыдущее описание сниженной пролиферативной способности Т-клеток CD8 + от пожилых людей 35 , эти данные предполагают аналогичное отсутствие корреляции между SRC и функциональностью в Т-клетках CD8 + человека. Более того, эти данные указывают на корреляцию между повышенным уровнем SRC и возрастным повышением чувствительности к IL-15 Т-клеток CD8 + человека.

Фиг. 6. Повышенная экспрессия IL-15Rβ и SRC в старых человеческих CD8 + Т-клетках.

a IL-15Rβ MFI непосредственно ex vivo на субпопуляциях CD8 Т-клеток от отдельных молодых (20–30 лет) или старше (60–80 лет) взрослых доноров ( n = 6–7) и b Репрезентативные гистограммы экспрессии IL-15Rβ с экспрессией на Т-клетках CD4 + , используемых в качестве контроля. c OCR для обогащенных CD8 + Т-клеток от молодых или пожилых доноров-людей и d изменение OCR для молодых или пожилых доноров-людей.Этот эксперимент проводился один раз. Столбцы или точки данных представляют собой среднее значение ± SEM. * Означает p ≤ 0,05, ** означает p ≤ 0,01, непарный тест t .

Крио-ЭМ структура активированного протонами хлоридного канала TMEM206

ВВЕДЕНИЕ

Хлорид-ионы (Cl ) являются наиболее распространенными анионами у животных; таким образом, движение Cl через клеточные мембраны, опосредованное каналами и переносчиками Cl , является центральным для множества клеточных функций, таких как регулирование объема клеток, подкисление внутриклеточных пузырьков и контроль возбудимости в мышечных клетках ( 1 , 2 ).Широко наблюдаемые в клетках млекопитающих активируемые кислотой или протонами внешне выпрямляющие токи Cl ( I Cl, H , также называемые ASOR или PAORAC) давно известны, но молекулярные компоненты, стоящие за этими токами оставались неуловимыми до недавнего времени ( 3 12 ). Два независимых исследования с использованием полногеномного скрининга РНК-интерференции идентифицировали TMEM206 в качестве основного анионного канала ( 13 , 14 ).Эволюционно консервативный у позвоночных TMEM206 воспроизводит биофизические характеристики протонно-активированных токов Cl , включая внешне выпрямляющуюся зависимость тока от напряжения ( I В ) и последовательность проницаемости SCN > I > НЕТ 3 > Br > Cl ( 13 , 14 ). Присутствие I Cl, H во всех исследованных типах клеток млекопитающих предполагает, что TMEM206 может универсально экспрессироваться во всех тканях и играть важную роль в клеточных ответах на внеклеточное закисление.Канал активируется при очень кислотном внеклеточном pH (от ~ 5,5 до 6,0), который может быть ограничен патологическими состояниями, такими как рак и ишемический инсульт ( 9 , 13 18 ), при котором I Токи Cl, H могут способствовать гибели клеток, вызванной тканевым ацидозом ( 6 , 19 ). В соответствии с этим представлением, делеция TMEM206 ослабляет индуцированную кислотой гибель клеток ( 13 , 14 ), предполагая, что фармакологическое ингибирование TMEM206 потенциально облегчает патологии, связанные с ацидозом.

Каналы Cl заметно разнообразны как по аминокислотной последовательности, так и по трехмерной (3D) архитектуре, что демонстрируется структурно и функционально охарактеризованными семействами каналов Cl , включая каналы CLC ( 1 ), Bestrophin ( 20 22 ), TMEM16 ( 23 26 ), регулятор трансмембранной проводимости при муковисцидозе ( 27 ), анион-селективные рецепторы Cys-петли ( 28 ) и анионные каналы с регулируемым объемом ( 29 31 ).Отсутствие сигнатурных последовательностей или структурных мотивов среди этих каналов создает серьезные проблемы в отношении молекулярной идентификации токов Cl , как в случае TMEM206 ( 13 , 14 ). Без заметной гомологии последовательностей с ранее охарактеризованными каналами Cl TMEM206, вероятно, представляет новый класс каналов Cl с отчетливой структурой субъединиц, сборкой каналов и механизмами ионной проводимости и активации.Здесь мы представляем структуру криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) pufferfish TMEM206, которая выявляет архитектуру тримерных каналов, которая отличается от ранее известных каналов Cl . В сочетании с электрофизиологией эта работа обеспечивает первое структурное и функциональное описание эволюционно законсервированного и широко экспрессируемого канала Cl и устанавливает молекулярную основу для понимания проводимости Cl и стробирования канала.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Стратегия слияния для определения структуры крио-ЭМ

Чтобы идентифицировать кандидатов TMEM206 для структурных исследований, мы экспрессировали несколько ортологов с С-концевым зеленым флуоресцентным белком (GFP) в дрожжах Pichia pastoris и проанализировали экспрессию и сборку каналов. профили с использованием эксклюзионной хроматографии с детектированием флуоресценции (FSEC) ( 32 ).Последующая крупномасштабная очистка определила рыбу-иглобрюху ( Takifugu rubripes ) TMEM206, которая имеет 50% идентичность последовательности с человеческим каналом (рис. S1), как многообещающую мишень, на что указывает хорошо разрешенная олигомерная сборка на эксклюзионной хроматографии (рис. . S2). Полноразмерный белок TMEM206 иглобрюха дикого типа очищали до гомогенности и подвергали одночастичному крио-ЭМ-анализу. Трехмерная реконструкция дала карту низкого разрешения (~ 6,2 Å), которая выявила архитектуру тримерных каналов как с трансмембранными, так и с экстрамембранными доменами (рис.S3). Тримерный канал имеет прогнозируемую молекулярную массу ~ 120 кДа и, вероятно, содержит неструктурированные сегменты. Таким образом, относительно небольшой размер частиц может стать проблемой при криоЭМ реконструкции с высоким разрешением. Кроме того, частицы были редко распределены на крио-ЭМ решетках (рис. S2), и приготовление решеток с более высокими концентрациями белка не улучшило плотность частиц, потому что каналы все больше склонялись к агрегации при стекловании.

Чтобы преодолеть эти технические трудности, мы слили канал с C-концевым BRIL (термостабилизированный апоцитохром b 562 RIL), белком пучка с четырьмя спиралями, который широко используется в качестве шаперона кристаллизации для повышения стабильности мембранного белка и способствуют образованию кристаллов ( 33 , 34 ).Чтобы потенциально облегчить выравнивание частиц с дополнительной молекулярной массой из BRIL, мы систематически укорачивали крайний С-конец Pufferfish TMEM206, который не консервативен среди ортологов и, скорее всего, неструктурирован, чтобы увеличить общую структурную жесткость между каналом и BRIL. На основе профилей FSEC мы выбрали конструкцию с удаленными последними четырьмя C-концевыми аминокислотами (фиг. 1A и фиг. S2, от A до F). Эта конструкция, которую мы назвали TMEM206 EM , содержит аминокислоты с 1 по 349 TMEM206 и BRIL иглобрюха.Очищенный TMEM206 EM показал заметно сниженную агрегацию при эксклюзионной хроматографии и продуцировал плотно распределенные частицы на крио-ЭМ решетках (рис. S2). Эти улучшения позволили нам получить крио-ЭМ реконструкцию с общим разрешением ~ 3,5 Å с наложенной симметрией C3 (рис. S4 и S5 и таблица S1). Качество карты плотности крио-ЭМ достаточно для построения модели de novo, руководствуясь громоздкими боковыми цепями. Части N- и C-концов (аминокислоты от 1 до 64 и от 335 до 349) и BRIL не были разрешены на карте плотности и, таким образом, были исключены из модели.Окончательная атомная модель, состоящая из остатков от 65 до 159, от 168 до 251 и от 255 до 334, имеет хорошую стереохимию и хорошо вписывается в плотность (рис. S5 и таблица S1). Модель также соответствует карте с более низким разрешением, рассчитанной для интактного канала дикого типа, указывая на то, что слияние BRIL не нарушает структурную целостность канала (рис. S6). Кроме того, при экспрессии в TMEM206 -нокаутированных клетках 293T эмбриональной почки человека (HEK) TMEM206 EM и полноразмерный иглобрюх дикого типа TMEM206 демонстрировали аналогичное соотношение I V , реакцию на дозу pH и анионная селективность (рис.1, B – E, и фиг. S7 и S8).

Рис. 1 Функция и строение иглобрюха TMEM206.

( A ) Схема конструкций каналов, используемых для электрофизиологии и одночастичных крио-ЭМ экспериментов. «Thr» представляет собой сайт расщепления тромбином. ( B и C ) Типичные следы тока целых клеток, активированных внеклеточным pH 4,6, для иглобрюхих TMEM206 (B) и TMEM206 EM (C). Канальные конструкции экспрессировали в TMEM206 нокаутных клетках 293Т эмбриональной почки человека (HEK).( D ) Нормализованные отношения тока к pH для иглобрюхих TMEM206 ( n = от 6 до 9 клеток на точку данных) и TMEM206 EM ( n = от 5 до 6 клеток на точку данных). Все токи регистрировали при комнатной температуре и нормировали на токи pH 4,0 при +100 мВ. ( E ) Селективность по аниону иглобрюхих TMEM206 и TMEM206 EM . Данные представлены в виде средних значений ± стандартная ошибка среднего (н.у., не значимо; тест Стьюдента t ). ( F ) Крио-ЭМ плотность фугу TMEM206 EM с контуром 7.0 σ и окрашены отдельными субъединицами. ( G ) Тримерная структура иглобрюха TMEM206 EM .

Тримерный канал Cl

TMEM206 образует симметричный тример, каждая субъединица которого содержит трансмембранный домен (TMD) с двумя межмембранными спиралями (TM1 и TM2) и большой внеклеточный домен (ECD), обогащенный β-цепями (Рис. 1, F и G). Внешняя спираль TM1 и внутренняя спираль TM2 в пределах одной субъединицы расположены примерно антипараллельно, под углом ~ 30 ° к нормали мембраны.ECD включает внутренний β-домен, расположенный вокруг центральной оси симметрии третьего порядка, и внешний β-домен со вставкой спираль-поворот-спираль (HTH), расположенный на периферии канала (рис. 2, от A до C). Внутренний β-домен, состоящий из β1, β3, β6 и от β9 до β12, далее организован в верхний и нижний слои, которые удерживаются вместе удлиненной парой антипараллельных β нитей β9 и β10. β1 и β12 в нижнем слое подключены к TM1 и TM2 соответственно. Помимо пары β9-β10, верхний слой содержит три дополнительных нити, β3, β6 и β11, и соединяется с нижним слоем через короткий линкер β11-β12.В отличие от компактного нижнего слоя, верхний слой ECD расширен периферическим внешним β-доменом, состоящим из β2, β4, β5, β7 и β8, а также вставкой HTH между β7 и β8. Обширные контакты боковой цепи, в основном за счет ван-дер-ваальсовых взаимодействий, участвуют в интерфейсе между внутренним и внешним β-доменами.

Рис. 2 Структура субъединицы и сборка каналов.

( A ) Структура одной субъединицы, показывающая трансмембранный домен (красный), внутренний β-домен (синий), внешний β-домен (оранжевый) и HTH (зеленый).Указаны элементы вторичной конструкции. ( B ) Сборка тримерного канала. Две из субъединиц показаны на поверхностном изображении. ( C ) Ортогональный вид, как на (B), с внеклеточной стороны.

Межсубъединичный интерфейс, вносимый ECD и TMD, скрывает ~ 2400 Å 2 молекулярной поверхности на субъединицу. Во внеклеточной области взаимодействия плотной упаковки ограничиваются двумя областями, верхней частью ECD и соединением ECD-TMD, оставляя значительные пустые пространства посередине между субъединицами (рис.3). Три субъединицы находятся в непосредственной близости на самом верху ECD, с боковыми цепями остатков F238 и K267, обращенными к центральной оси симметрии третьего порядка (Fig. 3A). Сбоку петли из соседних субъединиц пересекаются через сеть как ван-дер-ваальсовых взаимодействий, так и взаимодействий водородных связей (Fig. 3B). В частности, ароматическая боковая цепь F198 расположена в гидрофобном кармане от соседней субъединицы, состоящей из нескольких ароматических боковых цепей из F186, F268 и F283, и находится на расстоянии π-взаимодействия катиона с R239 от соседней субъединицы.Устойчивые межсубъединичные взаимодействия в самой верхней части ECD могут вносить вклад в создание стационарного структурного каркаса, который поддерживает стробирующие переходы, необходимые в дистальном переходе TMD и ECD-TMD.

Рис. 3 Интерфейс межподразделения.

( A ) Тримерный интерфейс на вершине ECD. Боковые цепи K267 и F238 выделены. ( B ) Вид сбоку на межсубъединичный интерфейс на верхнем уровне ECD. Остатки, задействованные в интерфейсе, показаны в виде стикеров.( C ) Боковой портал в середине ECD между двумя соседними субъединицами. Показаны поверхности и остатки облицовки стены. ( D ) Межсубъединичный интерфейс TM1-TM2.

Сборка тримерного канала вводит три боковых отверстия (боковые порталы) в середине внеклеточной области (Fig. 3C). В каждом портале внутренняя стенка преимущественно выстлана полярными и заряженными боковыми цепями, что, вероятно, способствует прохождению ионов и воды. Удлиненные боковые порталы доходят до места соединения ECD-TMD, где возобновляется плотное уплотнение.Короткие линкеры TM1-β1 и β12-TM2 создают узкую «шейку» непосредственно над липидной мембраной (рис. 3D). Внутри мембраны граница раздела тримеров в первую очередь опосредуется внутренней спиралью TM2, которая вместе с шейкой ограничивает центральный путь ионной проводимости. Взаимодействия боковой цепи также наблюдаются между TM2 и соседним TM1 на внеклеточном конце (Fig. 3D). Примечательно, что этот интерфейс показывает близкую близость между L85 в TM1 и W305 в TM2. В соответствии с представлением о том, что межсубъединичный интерфейс TM1-TM2, вероятно, участвует в регуляции активности канала, замены цистеина в эквивалентных положениях L85 и W305 в TMEM206 человека увеличивают токи I Cl, H при отрицательных напряжениях с приложением модифицирующего цистеин реагента MTSES (2-сульфонатоэтилметантиосульфонат) ( 14 ).

Путь проникновения ионов

Центральная пора ионной проводимости содержит множество сужений, которые могут препятствовать прохождению ионов (рис. 4, A и B), как показывает расчет радиуса поры ( 35 ). Таким образом, структура представляет собой непроводящую конформацию, которая соответствует условиям буферного раствора с высоким pH (pH 8,0), используемым для определения крио-ЭМ структуры. Интимная сборка в верхней части ECD размещает боковые цепи F238 в непосредственной близости, создавая сужение, которое разделяет верхний и центральный вестибюли.Объемный и удлиненный центральный вестибюль доступен с боков из-за отсутствия белок-белковых контактов в середине ECD (рис. 4C). Следовательно, узкая точка на F238 может не мешать ионной проводимости и может сохраняться во время цикла стробирования канала, когда ионы проходят через три боковых портала. Кроме того, слегка положительный электростатический потенциал внутренних стенок центрального вестибюля и боковых входов будет способствовать привлечению внеклеточного Cl (рис.4С).

Рис. 4 Путь проникновения ионов.

( A ) Структура TMEM206 EM и центральная пора ионной проводимости, показанная на изображении поверхности. Остатки, вызывающие сужения, выделены и помечены. Обозначен боковой портал. ( B ) Центральная пора с ионной проводимостью и оценка радиуса (правая панель). ( C ) Изображение поверхности канала, окрашенное поверхностным электростатическим потенциалом (красный, –5 кТ / э; белый, нейтральный; синий, +5 кТ / э).Обозначены боковой портал и цитоплазматический вестибюль. ( D ) Внеклеточные ворота на стыке ECD-TMD. V101, T301 и N303 показаны в виде ручки. ( E ) Трансмембранный вентиль, состоящий из I310, G313 и M316. ( F ) Предполагаемый фильтр селективности, определяемый K320. Также показаны плотности боковых цепей для K320 с контуром 6,5 σ. ( G и H ) Плотность тока с внеклеточным pH 7,3 (G) и 4,6 (H) при +100 мВ для мутантов TMEM206.Токи межклеточной мембраны регистрировали с использованием линейного изменения напряжения от -100 до +100 мВ в течение 500 мс при удерживающем потенциале 0 мВ. ( I ) Отношение плотности тока при pH 4,6 к pH 7,3.

В месте соединения ECD-TMD три нити β1, соединенные с внешними спиралями, пересекаются друг с другом, и три нити β12 перемещаются внутрь, чтобы соединиться с внутренними спиралями (рис. 4D). Такое расположение создает внеклеточные ворота, которые образованы V101 в β1 и T301 и N303 в линкере β12-TM2 над липидным бислоем (рис.4D). Под внеклеточными воротами и внутри мембраны поры для ионной проводимости выстланы остатками от внутренних спиралей TM2, которые пересекаются друг с другом по консервативному остатку глицина G313 под углом ~ 60 ° (Fig. 4E). Последовательные сужения в позициях, обращенных к порам, I310, G313 и M316, по-видимому, образуют гидрофобные ворота, которые препятствуют ионной проводимости (рис. 4E). Под воротами боковые цепи высококонсервативного основного остатка K320 указывают на центральную пору, предположительно составляя фильтр селективности анионов (рис.4F и рис. S1) ( 14 ). Непосредственно под фильтром ионная пора существенно расширяется на цитоплазматической стороне по мере того, как внутренние спирали расходятся дальше друг от друга.

Чтобы подтвердить наши структурные данные, мы выполнили исследования мутагенеза ключевых остатков выстилки пор (рис. 4, G – I и рис. S9). Замена консервативного основного остатка K320 на аланин или кислотные остатки устраняет токи, активируемые кислотой I Cl, H . В отличие от этого, замещение аргинина сохранило функцию канала, дополнительно поддерживая требование положительных зарядов в анион-селективном фильтре.Мутации M316 (M316A / D / E / K) также отменили токи I Cl, H , что свидетельствует о важности этого положения, обращенного к порам, прямо над предполагаемым фильтром селективности. Мутации V101A и V101F приводили к увеличению токов как при pH 7,3, так и при pH 4,6, но кратность активации при низком pH снижалась, предполагая, что эти мутации, вероятно, увеличивали как базальную вероятность открытия при высоком pH, так и унитарную проводимость. Замена объемного остатка F238 (F238A) аланином, который образует сужение в верхнем преддверии, привело к свойствам канала, аналогичным свойствам мутации V101.

Предыдущие исследования доступности с помощью сканирования цистеина всех спиралей TM1 и TM2 человеческого TMEM206 показали, что внешняя спираль TM1 в основном нечувствительна к заменам цистеина ( 14 ). Напротив, внутренняя спираль TM2 несла множественные замены цистеина, которые отображали либо увеличенные, либо уменьшенные токи I Cl, H в ответ на приложение MTSES ( 14 ). Из 44 замен цистеина только L309C и K319C в TM2 (соответствующие I310 и K320 в TMEM206 иглобрюхих) не смогли вызвать токи I Cl, H , активируемые кислотой ( 14 ).В свете нашей структуры эти эксперименты подчеркивают важную роль этих двух остатков выстилки пор. В частности, I310 является критическим компонентом трансмембранного затвора, а K320 образует фильтр селективности анионов (рис. 4, E и F). G313 и M316 являются двумя оставшимися остатками, которые составляют трансмембранные ворота TMEM206 иглобрюхих. Соответствующие замены цистеина в TMEM206 человека (G312C и L315C) показали выраженное MTSES-зависимое увеличение токов I Cl, H ( 14 ).Кроме того, введение кислотного остатка в положение 315 (L315D), которое на один виток спирали выше фильтра анионной селективности, состоящего из остатков лизина (рис. 4E), сделало канал неселективным с проницаемостью как для катионов, так и для анионов. из-за нейтрализации заряда в области фильтра ( 14 ). В совокупности ключевые остатки выстилки поры, имеющие функциональное значение для стробирования и селективности, идентифицированные с помощью систематических экспериментов по замене цистеина, находятся в соответствии с нашими структурными и электрофизиологическими данными.Кроме того, эти данные подтверждают структурную консервацию между ортологами человека и иглобрюха и что наша структура TMEM206 EM представляет собой физиологически релевантную модель для всего семейства каналов Cl .

Структурная конвергенция катионных и анионных каналов

Удивительно, но топология, структура и сборка TMEM206 напоминают таковые эпителиального натриевого канала (ENaC) / суперсемейства дегенерина ионных каналов, включая кислоточувствительные ионные каналы (ASIC). и ENaC (рис.5, от A до D), несмотря на отсутствие заметной гомологии аминокислотной последовательности ( 36 38 ). Эти тримерные каналы, селективные для противоположно заряженных ионов Na + и Cl , имеют общую структуру ядра, состоящую из 12-нитевого β-домена, фланкированного двумя трансмембранными спиралями. Β-домены в этих каналах имеют одинаковую топологию и хорошо выстраиваются друг с другом (рис. 5D). TMEM206 содержит простую вставку HTH во внешний β-домен, тогда как ASIC и ENaC снабжены более сложными структурными элементами, окружающими внешний β-домен (рис.5, А – Г). Структуры ASIC1a обнаруживают центральный путь проникновения ионов, аналогичный таковому у TMEM206, включая верхние, центральные и цитоплазматические вестибюли и множественные сужения (Fig. 5, E и F). Кроме того, ASIC1a содержит внеклеточный вестибюль и фенестрации, которые увеличиваются при активации канала, чтобы обеспечить проводимость ионов, оставляя внеклеточные сужения вдоль центрального пути в значительной степени неизменными (Рис. 5F) ( 36 , 37 ). Напротив, в TMEM206 центральный вестибюль открывается в сторону, и ионы Cl могут проникать в центральную пору через три боковых портала (рис.5E). Однако TMEM206 лишен внеклеточного преддверия и фенестраций на границе ECD-мембраны. Т.о., в TMEM206 внеклеточные ворота между центральным вестибюлем и трансмембранной порой должны расширяться, чтобы пропускать ионы, если только внеклеточные фенестрации, подобные таковым в ASIC1a, не синтезируются заново при активации канала.

Рис. 5 Структурное сравнение с ASIC и ENaC.

( A, C ) Структуры субъединиц TMEM206 (A), ASIC1a [банк данных белков (PDB): 6AVE] (B) и ENaC (PDB: 6BQN) (C).Аналогичным образом окрашены домены. ( D ) Наложение TMEM206, окрашенного, как на (A), и ASIC1a, окрашенного в голубой цвет. ( E ) Тримерный канал TMEM206 и его центральная пора ионной проводимости. Пора оценивается с помощью программы HOLE и отображается в виде цветных точек (радиус поры: красный <1,15 Å <зеленый <2,3 Å <синий). ( F ) Тримерный канал ASIC1a и центральная пора в закрытом (в центре, PDB: 6AVE) и открытом (справа, PDB: 4NTW) состояниях.

ENaC активируются высвобождением ингибирующих пептидов посредством протеолиза в ECD, тогда как ASIC и TMEM206 активируются внеклеточными протонами ( 13 , 14 , 37 , 38 ).В ASIC1a электростатически отрицательный «кислотный карман», образованный между β-доменом и периферическими доменами на границе раздела субъединиц, принимает расширенную конформацию в состоянии покоя и коллапсирует под воздействием внеклеточных протонов, что приводит к расширению нижнего β-домена. и радужное отверстие трансмембранного затвора ( 36 , 37 ). Напротив, TMEM206 лишен дополнительных структурных элементов, участвующих в формировании кислотного кармана, как в ASIC1a, что указывает на особый механизм чувствительности к кислоте.Тем не менее, консервативные титруемые аминокислоты в кластере внеклеточной области на межсубъединичном интерфейсе (фиг. S1 и S10) создают интересную возможность того, что «кислотный сенсор» в TMEM206 может быть расположен на границе раздела субъединиц. Примечательно, что в ASIC1a L414 и N415 из линкера β11-β12, который разграничивает верхний и нижний β-домены, служат в качестве молекулярного «сцепления», меняя ориентацию боковых цепей, чтобы способствовать десенсибилизации каналов при длительном воздействии протонов ( 37 ).В TMEM206 консервативные титруемые остатки (R289 и D290 в TMEM206 иглобрюха) из линкера β11-β12 могут играть сравнимую роль во время стробирования канала (фиг. S1 и S10). Консервированные структурные особенности между TMEM206 и ASICs дополнительно подтверждают вероятность аналогичных стробирующих конформационных изменений, таких как относительно стационарный структурный каркас в верхнем ECD, расширение нижнего β-домена и радужное отверстие ворот в мембране.

ОБСУЖДЕНИЕ

Одночастичная крио-ЭМ облегчила определение структуры интегральных мембранных белков, которые недостижимы с помощью традиционной рентгеновской кристаллографии.Однако достижение почти атомарного разрешения для мембранных белков небольшого размера остается серьезной технической проблемой из-за низкого контраста и отношения сигнал / шум ( 39 ). В данной работе мы получили структуру канала с разрешением 3,5 Å с упорядоченной частью всего ~ 90 кДа. Это стало возможным благодаря слиянию с маленьким шапероном кристаллизации BRIL, который оказался полезным для улучшения стабильности в других отношениях субоптимальных мембранных белков и для стимулирования упаковки кристаллов ( 33 ).Улучшение разрешения стало возможным благодаря значительному увеличению плотности частиц на крио-ЭМ решетках в результате повышенной гомогенности и снижения агрегации, а не увеличения молекулярной массы, поскольку BRIL был невидим на карте плотности. Возможно, благодаря гибкой связи между каналом и BRIL структурная и функциональная целостность сохраняется в конструкции слияния TMEM206 EM . По аналогии с кристаллографией, стратегия слияния BRIL может быть широко применима для одночастичных крио-ЭМ-исследований небольших по своей природе и нестабильных мембранных белков.

Эта работа теперь определяет структуру и сборку нового класса каналов Cl TMEM206 и устанавливает основу для дальнейших функциональных и механистических исследований. Чтобы получить представление о структуре протонной активации, мы попытались определить структуры TMEM206 EM при низком pH (~ 5,0), но не смогли получить значимые крио-ЭМ реконструкции. Примечательно, что структура канала TMEM206 Cl очень похожа на структуру каналов ASIC и ENaC, селективных по Na + , которые не связаны между собой по аминокислотной последовательности и проводят положительно, а не отрицательно заряженные ионы ( 36 38 ).Консервированная структура ядра предполагает, что эти каналы, селективные либо для катионов, либо для анионов, могут испытывать аналогичные изменения конформации ворот.

Во время пересмотра нашей рукописи были опубликованы крио-ЭМ структуры человеческого TMEM206 в непроводящем состоянии как при высоком, так и при низком pH ( 40 ). Общие структуры каналов человека и рыбы-иглобрюха в состояниях покоя с высоким pH схожи, что предполагает сохранение структуры и потенциально механизмы активации среди членов семьи.В соответствии с нашим предположением, что консервативный остаток лизина в TM2 (K320 у иглобрюхих TMEM206) важен для ионной селективности, мутация эквивалентного остатка лизина в TMEM206 человека (K319E) сделала катионный канал селективным ( 40 ). Вместе эти исследования дают начальное представление о структуре и функциях семейства каналов TMEM206. Дополнительные структуры, представляющие открытые проводящие конформации, необходимы для понимания механизмов кислотной активации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экспрессия и очистка белка

Синтезированы кодон-оптимизированные фрагменты ДНК, кодирующие 16 ортологов TMEM206 (Bio Basic Inc.). Для сверхэкспрессии в дрожжах P. pastoris фрагменты ДНК переносили в модифицированный вектор pPICZ-B с сайтом расщепления протеазой PreScission, за которым следует C-концевой тег GFP-His 10 . Иглобрюх TMEM206 был идентифицирован как многообещающий кандидат для структурных исследований по оценке FSEC. Первоначальный крио-ЭМ-анализ с использованием полноразмерного белка дикого типа показал, что очищенные каналы склонны к агрегации на крио-ЭМ сетках, что препятствует определению структуры с высоким разрешением.Для улучшения биохимической стабильности канала BRIL (термостабилизированный апоцитохром b 562 RIL) был слит с С-концом иглобрюха TMEM206. Для увеличения структурной жесткости слитой конструкции последние четыре С-концевых остатка TMEM206 были дополнительно удалены. Экспрессионная конструкция TMEM206 EM включает остатки с 1 по 349 TMEM206 иглобрюхих и C-концевой BRIL, за которым следует сайт расщепления протеазой PreScission и тег GFP-His 10 . Для электрофизиологических записей фрагменты ДНК лигировали в модифицированный вектор pCEU, содержащий C-концевую метку GFP-His 8 .Мутации, использованные в этом исследовании, были вызваны сайт-направленным мутагенезом.

Клетки дрожжей, экспрессирующие полноразмерную фугу дикого типа TMEM206, разрушали измельчением (Retsch MM400) и ресуспендировали в буфере, содержащем 50 мМ трис (pH 8,0) и 150 мМ NaCl с добавлением дезоксирибонуклеазы I и ингибиторов протеаз, включая лейпептин (2,5 мкг / мл), пепстатин А (1 мкг / мл), 4- (2-аминоэтил) бензолсульфонилфторид гидрохлорид (100 мкг / мл), апротинин (3 мкг / мл), 1 мМ бензамидин и 200 мкМ фенилметансульфонилфторид.Смесь клеток экстрагировали 1% (мас. / Об.) Неопентилгликолем лаурилмальтозы (Anatrace) в течение 2 часов при перемешивании при 4 ° C, а затем центрифугировали в течение 1 часа при 30,000 g . Супернатант собирали и инкубировали с 3 мл смолы, заряженной кобальтом (G-Biosciences), в течение 3 часов при 4 ° C. Затем смолу собирали и промывали 30 мл буфера с 20 мМ трис (pH 8,0), 150 мМ NaCl, 20 мМ имидазолом и 85 мкМ глико-диосгенином (GDN; Anatrace). Канальный белок элюировали 200 мМ имидазолом и расщепляли протеазой PreScission при 4 ° C в течение ночи для удаления С-концевой метки GFP-His 10 .Дальнейшую очистку проводили на гель-фильтрационной колонке Superose 6 Increase 10/300 (GE Healthcare Life Sciences) в 20 мМ трис (pH 8,0), 150 мМ NaCl и 40 мкМ GDN. Пиковые фракции, содержащие белок канала, концентрировали до ~ 6 мг / мл и сразу же использовали для приготовления крио-ЭМ сетки. Очистка TMEM206 EM проводилась по той же процедуре, что и для дикого типа, за исключением того, что экстракт полярных липидов сои (0,05 мг / мл; Avanti Polar Lipids Inc.) был включен в буферы для промывки, элюирования и гель-фильтрации.

Подготовка крио-ЭМ сетки и визуализация

Крио-ЭМ сетки были приготовлены путем нанесения свежеочищенного канального белка (~ 3,5 мкл) на светящиеся медные углеродные сетки Quantifoil R2 / 2 с дырочками (Quantifoil), которые затем подвергались блоттингу в течение 2 s с влажностью ~ 100% и мгновенной заморозкой в ​​жидком этане с использованием FEI Vitrobot Mark IV (FEI). Изображения были получены с использованием электронного микроскопа Titan Krios (FEI), работающего при 300 кВ, с детектором Gatan K2 Summit (Gatan) и фильтром квантовой энергии Gatan Imaging Filter с шириной щели 20 эВ.Сбор данных производился с помощью программного обеспечения EPU (https://fei.com/software/epu-automated-single-particles-software-for-life-sciences/) в режиме сверхвысокого разрешения с размером пикселя 0,55 Å и номинальный диапазон расфокусировки от -1,0 до -2,5 мкм. При дозе ~ 7,8 электронов / Å 2 в секунду каждая микрофотография записывалась в течение 8 с на 40 кадрах (накопленная доза ~ 62 электрона / Å 2 ).

Обработка данных и расчет карты

Записанные микрофотографии были скорректированы по движению и взвешены по дозе с использованием MotionCor2 ( 41 ).Микрофотографии, взвешенные по дозе, были подвергнуты определению функции передачи контраста (CTF) с использованием GCTF ( 42 ). После коррекции движения и оценки CTF микрофотографии низкого качества были вручную удалены из наборов данных. Для набора данных иглобрюха TMEM206 EM был использован автопикинг на основе лапласиана-гаусса для отбора 7629 частиц из случайно выбранных микрофотографий для создания 2D-классов для автоматического выбора в RELION3 ( 43 ). Хорошие 2D-классы (2827 частиц) были использованы в качестве шаблонов для автоматического выделения из 3411 микрофотографий, в результате чего в общей сложности получилось 1 809 512 частиц.Частицы были извлечены с использованием прямоугольника размером 220 пикселей и подверглись двухмерной классификации с диаметром маски 170 Å. После двух раундов 2D-классификации было отобрано 835 518 частиц и импортировано в cryoSPARC ( 44 ). Затем в cryoSPARC была создана начальная карта, которая использовалась для автоматического уточнения 3D в RELION3, в результате чего была получена карта с разрешением 4,03 Å. Кроме того, трехмерная классификация, запрашивающая шесть классов, выявила два класса, показывающих полные характеристики канала (505 115 частиц). Эти два класса были объединены и подвергнуты 3D-обработке с последующим уточнением CTF и байесовской полировкой.Окончательная реконструкция достигла общего разрешения 3,46 Å от замаскированного уточнения с симметрией C3.

Для полноразмерного канала иглобрюхих рыб в результате автоматического отбора было получено 430 043 частицы из 1308 микрофотографий. После двух раундов 2D-классификации было выбрано 49 851 частицы для создания начальной карты в cryoSPARC для 3D-классификации, запрашивающей четыре класса в RELION3. Были выбраны два класса, соответствующие полному каналу (31 362 частицы), которые подверглись замаскированному 3D-уточнению, что дало реконструкцию с общим разрешением 6.17 Å после постобработки.

Построение, уточнение и проверка модели

Построение модели De novo с учетом плотности объемных боковых цепей и дисульфидных связей проводилось в COOT ( 45 ). Циклы построения модели в COOT и уточнения в реальном пространстве с использованием real_space_refine по сравнению с полной картой в PHENIX ( 46 ) были выполнены для получения окончательной уточненной атомной модели, которая была проверена с помощью MolProbity ( 47 ). Окончательная модель включает остатки от 65 до 159, от 168 до 251 и от 255 до 334.Плотности боковых цепей остатков 65-76 и 321-334 плохо определены, и поэтому эти остатки были смоделированы как аланин. Расчет радиуса пор производился с помощью программы HOLE ( 35 ). Структурные фигуры были визуализированы с использованием PyMol (pymol.org).

Электрофизиология

Нокаут человеческого гена TMEM206 в клеточной линии HEK293T проводили с использованием CRISPR-Cas9-опосредованного разрушения гена ( 48 ). Ген TMEM206 был нацелен с использованием описанной последовательности направляющей РНК (гРНК; 5′-GGACCGAGAAGACGTTCTTC-3 ‘, отрицательная цепь) ( 13 ).ПРНК вставляли в плазмиду PX459 V2.0 (Addgene, каталожный номер 62988) и трансфицировали в клетки HEK293T с использованием реагента для трансфекции FuGENE HD (Promega). Через 24 часа клетки переносили в свежую среду с пуромицином (5 мкг / мл) еще на 7 дней. Затем отдельные колонии выделяли с использованием предельного разведения. Нокаутную клеточную линию определяли путем анализа генотипа мутаций сдвига рамки считывания с помощью целевой сайт-специфической полимеразной цепной реакции и клонирования с последующим секвенированием по Сэнгеру.

Линию нокаутных клеток TMEM206 использовали для электрофизиологических экспериментов. С-концевой GFP-меченный канал TMEM206 иглобрюха дикого типа или каждый мутантный канал трансфицировали. Запись целых клеток с помощью патч-клампа выполнялась при комнатной температуре с использованием усилителя Axon 700B (Molecular Devices). Пипетки извлекали из боросиликатного стекла (BF 150-86-10; Sutter Instrument) с помощью пипетки Sutter P-1000 и заполняли внутриклеточным раствором, содержащим 135 мМ CsCl, 1 мМ MgCl 2 , 2 мМ CaCl 2 , 10 мМ Hepes, 5 мМ EGTA, 4 мМ MgATP (от 280 до 290 мОсм / кг; pH 7.2 с CsOH). Внешний раствор содержал 145 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 2 мМ MgCl 2 , 1,5 мМ CaCl 2 , 10 мМ Hepes, 10 мМ глюкозы (300 мОсм / кг; pH 7,3 с NaOH). Для приготовления растворов с различной кислотностью pH в качестве буфера использовали 5 мМ Na 3 -цитрат, и pH регулировали с помощью лимонной кислоты. Удерживая при 0 мВ, для регистрации токов всей клетки использовали линейное изменение напряжения от -100 до +100 мВ в течение 500 мс. Токи иглобрюхов TMEM206 и мутантов были нормализованы по емкости клеток для расчета плотности тока.Для экспериментов по анионной селективности растворы ванны были заменены 145 мМ NaX / 5 мМ Na 3 -цитрат (pH 4,6 был доведен до лимонной кислоты), где X был Cl , Br и I , соответственно. Данные были получены с использованием программного обеспечения Clampex 10.4 (Molecular Devices). Токи фильтровались на 2 кГц и оцифровывались на 10 кГц. Данные были проанализированы и нанесены на график с помощью Clampfit 10 (Molecular Devices). Кривая концентрация-ответ была аппроксимирована логистическим уравнением Y = Y мин + ( Y макс Y мин ) / (1 + 10 ^ [(logpH 50 X ) × уклон холма]), где Y – это отклик при заданном pH, Y max и Y min – максимальный и минимальный отклики, X – логарифмическое значение pH, а наклон Хилла – коэффициент наклона кривой.pH 50 – это значение pH, которое дает ответ на полпути между Y max и Y min . Коэффициенты проницаемости были рассчитаны на основе сдвигов обратного потенциала с помощью уравнения Гольдмана-Ходжкина-Каца. Все данные представлены как средние значения ± стандартная ошибка среднего.

Иммунофлуоресцентное окрашивание

Клетки HEK293T с нокаутом TMEM206 трансфицировали GFP-меченным TMEM206 иглобрюха и мутантами. Через 24 часа после трансфекции клетки фиксировали 4% параформальдегидом в течение 30 минут и дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS).Для окрашивания клеточных мембран клетки инкубировали с агглютинином зародышей пшеницы (WGA; 1: 400, Biotium), меченным Biotium CF 594 (5 мкг / мл в сбалансированном солевом растворе Хенкса без фенолового красного) в течение 10 мин при 37 °. C согласно инструкции производителя. После промывки PBS клетки помещали с 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом Fluromount-G (SouthernBiotech) и анализировали с использованием конфокального микроскопа Nikon. Для анализа совместной локализации были отобраны 50 клеток для каждой конструкции канала, по крайней мере, из трех различных покровных стекол.Коэффициенты совместной локализации области GFP + в области WGA + , проанализированные ImageJ, представляют уровни экспрессии на плазматической мембране. Все данные были собраны и проанализированы с помощью GraphPad prism 7.0.

Благодарности: Мы благодарим сотрудников лаборатории Юань за обсуждение. Финансирование: Эта работа была частично поддержана грантами NIH П.Я. (R01NS099341 и R01NS109307) и H.H. (R01AA027065 и R01DK103901). M.J.R. и J.A.J.F. поддерживаются Центром клеточной визуализации Вашингтонского университета, который частично финансируется Школой медицины Вашингтонского университета, Детским институтом открытий Вашингтонского университета и Св.Детская больница Луи (CDI-CORE-2015-505 и CDI-CORE-2019-813) и Фонд больницы Барнс-Еврей (3770). Автор: Z.D. спланировал эксперименты и провел биохимические препараты, крио-ЭМ эксперименты, структурное определение и анализ. J.Z. помогли биохимические препараты. Y.Z., J.F. и H.H. проводили электрофизиологические эксперименты. H.Z. создал линию клеток КО для электрофизиологии. M.J.R., J.A.J.F. и Z.D. выполнил сбор крио-ЭМ данных.П.Я. задумал и руководил проектом. Z.D., Y.Z., J.F., H.H. и P.Y. проанализировали результаты и подготовили рукопись при участии всех авторов. Конкурирующие интересы: Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов. Доступность данных и материалов: Все данные, необходимые для оценки выводов в статье, представлены в статье или дополнительных материалах. Крио-ЭМ карты депонированы в Банк данных электронной микроскопии с кодами доступа EMD-22342 и EMD-22343.Координаты атомов были депонированы в банк данных белков (PDB) с кодом доступа 7JI3. Для корреспонденции и запросов материалов обращаться к П.Ю. (юаньп {ат} wustl.edu).

Аквапорины | Геномная биология

  • 1.

    Хейманн Дж. Б., Энгель А: Аквапорины: филогения, структура и физиология водных каналов. Новости Physiol Sci. 1999, 14: 187-193.

    PubMed CAS Google Scholar

  • 2.

    Hohmann S, Bill RM, Kayingo G, Prior BA: Микробные каналы MIP.Trends Microbiol. 2000, 8: 33-38. 10.1016 / S0966-842X (99) 01645-5.

    PubMed CAS Статья Google Scholar

  • 3.

    Мурата К., Мицуока К., Хираи Т., Вальц Т., Агре П., Хейманн Дж. Б., Энгель А., Фудзиёси Ю.: Структурные детерминанты проникновения воды через аквапорин-1. Природа. 2000, 407: 599-605. 10.1038 / 35036519.

    PubMed CAS Статья Google Scholar

  • 4.

    Fu DX, Libson A, Miercke LJW, Weitzman C, Nollert P, Krucinski J, Stroud RM: Структура глицерин-проводящего канала и основа его селективности. Наука. 2000, 290: 481-486. 10.1126 / science.290.5491.481.

    PubMed CAS Статья Google Scholar

  • 5.

    Зардоя Р. Филогения и эволюция основного внутреннего семейства белков. Biol Cell. 2005, 97: 397-414.

    PubMed CAS Статья Google Scholar

  • 6.

    King LS, Kozono D, Agre P: От структуры к болезни: развивающаяся история биологии аквапоринов. Nat Rev Mol Cell Biol. 2004, 5: 687-698. 10.1038 / nrm1469.

    PubMed CAS Статья Google Scholar

  • 7.

    Johanson U, Karlsson M, Johansson I, Gustavsson S, Sjovall S, Fraysse L, Weig AR, Kjellbom P: Полный набор генов, кодирующих основные внутренние белки в арабидопсисе , обеспечивает основу для новой номенклатуры для основных внутренних белков растений.Plant Physiol. 2001, 126: 1358-1369. 10.1104 / pp.126.4.1358.

    PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

  • 8.

    Куигли Ф., Розенберг Дж., Шахар-Хилл Й., Бонерт Х .: От генома к функции: аквапорины Arabidopsis . Genome Biol. 2001, 3: research0001.1-0001.17. 10.1186 / gb-2001-3-1-research0001.

    Артикул Google Scholar

  • 9.

    Sandal NN, Marcker KA: Нодулин 26 сои гомологичен основному внутреннему белку мембраны волокна хрусталика крупного рогатого скота. Nucleic Acids Res. 1988, 16: 9347-9348.

    PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

  • 10.

    Дин Р.М., Риверс Р.Л., Зейдель М.Л., Робертс Д.М.: Очистка и функциональное восстановление нодулина сои 26. Аквапорин со свойствами транспорта воды и глицерина. Биохимия.1999, 38: 347-353. 10.1021 / bi982110c.

    PubMed CAS Статья Google Scholar

  • 11.

    Preston GM, Agre P: Выделение кДНК интегрального мембранного белка эритроцитов 28 килодальтон: член древнего семейства каналов. Proc Natl Acad Sci USA. 1991, 88: 11110-11114.

    PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

  • 12.

    Престон Г.М., Кэрролл Т.П., Гуджино В.Б., Agre P: Появление водных каналов в ооцитах Xenopus , экспрессирующих белок CHIP28 красных клеток. Наука. 1992, 256: 385-387.

    PubMed CAS Статья Google Scholar

  • 13.

    Юнг Дж. С., Престон Г. М., Смит Б. Л., Гуджино В. Б., Агре П: Молекулярная структура водного канала через аквапорин ЧИП. Модель песочных часов. J Biol Chem. 1994, 269: 14648-14654.

    PubMed CAS Google Scholar

  • 14.

    Walz T, Hirai T, Murata K, Heymann JB, Mitsuoka K, Fujiyoshi Y, Smith BL, Agre P, Engel A: Трехмерная структура аквапорина-1. Природа. 1997, 387: 624-627. 10.1038 / 42512.

    PubMed CAS Статья Google Scholar

  • 15.

    Сапаров С.М., Козоно Д., Роте У, Агре П., Поль П.: Проникновение воды и ионов аквапорина-1 в плоские липидные бислои: основные различия в структурных детерминантах и ​​стехиометрии. J Biol Chem.2001, 276: 31515-31520. 10.1074 / jbc.M104267200.

    PubMed CAS Статья Google Scholar

  • 16.

    Yool AJ, Weinstein AM: Новые роли старых дырок: функция ионных каналов в аквапорине-1. Новости Physiol Sci. 2002, 17: 68-72.

    PubMed CAS Google Scholar

  • 17.

    Calamita G: водный канал Escherichia coli aquaporin-Z. Mol Microbiol.2000, 37: 254-262. 10.1046 / j.1365-2958.2000.02016.x.

    PubMed CAS Статья Google Scholar

  • 18.

    Агре П., Козоно Д.: Водные каналы аквапоринов: молекулярные механизмы заболеваний человека. FEBS Lett. 2003, 555: 72-78. 10.1016 / S0014-5793 (03) 01083-4.

    PubMed CAS Статья Google Scholar

  • 19.

    Саадун С., Пападопулос М.С., Хара-Чикума М., Веркман А.С.: Нарушение ангиогенеза и миграции клеток из-за целенаправленного разрушения гена аквапорина-1.Природа. 2005, 434: 786-792. 10.1038 / природа03460.

    PubMed CAS Статья Google Scholar

  • 20.

    Тайерман С.Д., Бонерт Х.Дж., Маурел С., Стейдл Э., Смит Дж.А.К .: Аквапорины растений: их молекулярная биология, биофизика и значение для водных отношений растений. Exp Bot. 1999, 50: 1055-1071. 10.1093 / jexbot / 50.suppl_1.1055.

    CAS Google Scholar

  • 21.

    Луу Д.Т., Маурел К. Аквапорины в сложной среде: молекулярные механизмы для регулирования водного статуса растений.Plant Cell Environ. 2005, 28: 85-96. 10.1111 / j.1365-3040.2004.01295.x.

    CAS Статья Google Scholar

  • 22.

    Ishikawa F, Suga S, Uemura T., Sato MH, Maeshima M: SIP аквапоринов нового типа в основном локализованы на мембране ER и демонстрируют клеточно-специфическую экспрессию в Arabidopsis thaliana . FEBS Lett. 2005, 579: 5814-5820.

    PubMed CAS Статья Google Scholar

  • 23.

    Kaldenhoff R, Grote K, Zhu JJ, Zimmermann U: Значение аквапоринов плазмалеммы для водного транспорта у Arabidopsis thaliana . Плант Дж. 1998, 14: 121-128. 10.1046 / j.1365-313X.1998.00111.x.

    PubMed CAS Статья Google Scholar

  • 24.

    Siefritz F, Tyree MT, Lovisolo C, Schubert A, Kaldenhoff R: Аквапорины плазматической мембраны PIP1 в табаке: от клеточных эффектов до функции в растениях. Растительная клетка.2002, 14: 869-876. 10.1105 / tpc.000901.

    PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

  • 25.

    Martre P, Morillon R, Barrieu F, North GB, Nobel PS, Chrispeels MJ: Аквапорины плазматических мембран играют важную роль при восстановлении после дефицита воды. Plant Physiol. 2002, 130: 2101-2110. 10.1104 / стр.009019.

    PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

  • 26.

    Аарон Р., Шахак И., Винингер С., Бендов Р., Капульник Ю., Галили Г.: Сверхэкспрессия аквапорина плазматической мембраны в трансгенном табаке улучшает жизнеспособность растений при благоприятных условиях роста, но не при засухе или солевом стрессе. Растительная клетка. 2003, 15: 439-447. 10.1105 / tpc.009225.

    PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

  • 27.

    Moshelion M, Becker D, Biela A, Uehlein N, Hedrich R, Otto B, Levi H, Moran N, Kaldenhoff R: Аквапорины плазматической мембраны в моторных клетках Samanea saman : суточная и циркадная регуляция .Растительная клетка. 2002, 14: 727-739. 10.1105 / tpc.010351.

    PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

  • 28.

    Siefritz F, Otto B, Bienert GP, van der Krol A, Kaldenhoff R: Аквапорин NtAQP1 плазматической мембраны является ключевым компонентом механизма разворачивания листьев табака. Плант Дж. 2004, 37: 147-155.

    PubMed CAS Статья Google Scholar

  • 29.

    Cooper GJ, Zhou YH, Bouyer P, Grichtchenko II, Boron WF: Транспорт летучих растворенных веществ через AQP1. J Physiol. 2002, 542: 17-29. 10.1113 / jphysiol.2002.023218.

    PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

  • 30.

    Fang XH, Yang BX, Matthay MA, Verkman AS: данные против аквапорин-1-зависимой проницаемости CO 2 в легких и почках. J Physiol. 2002, 542: 63-69. 10.1113 / jphysiol.2001.013813.

    PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

  • 31.

    Uehlein N, Lovisolo C, Siefritz F, Kaldenhoff R: Табачный аквапорин NtAQP1 представляет собой мембранную пору CO 2 с физиологическими функциями. Природа. 2003, 425: 734-737. 10.1038 / природа02027.

    PubMed CAS Статья Google Scholar

  • 32.

    Niemietz CM, Tyerman SD: Канал-опосредованное проникновение газообразного аммиака через перибактероидную мембрану клубеньков сои.FEBS Lett. 2000, 465: 110-114. 10.1016 / S0014-5793 (99) 01729-9.

    PubMed CAS Статья Google Scholar

  • 33.

    де Гроот Б.Л., Грубмюллер Х .: Проникновение воды через биологические мембраны: механизм и динамика аквапорина-1 и GlpF. Наука. 2001, 294: 2353-2357. 10.1126 / science.1062459.

    PubMed CAS Статья Google Scholar

  • 34.

    де Гроот Б.Л., Фригато Т., Хелмс В., Грубмюллер Х .: Механизм исключения протонов в водном канале аквапорина-1.J Mol Biol. 2003, 333: 279-293. 10.1016 / j.jmb.2003.08.003.

    PubMed CAS Статья Google Scholar

  • 35.

    Янг Б., Веркман А.С.: Проницаемость аквапоринов 1-5 и MIP для воды и глицерина, определенная количественно путем экспрессии меченных эпитопом конструкций в ооцитах Xenopus . J Biol Chem. 1997, 272: 16140-16146. 10.1074 / jbc.272.26.16140.

    PubMed CAS Статья Google Scholar

  • 36.

    Chaumont F, Barrieu F, Jung R, Chrispeels MJ: Внутренние белки плазматической мембраны из кластера кукурузы в двух подгруппах последовательностей с различной активностью аквапоринов. Plant Physiol. 2000, 122: 1025-1034. 10.1104 / pp.122.4.1025.

    PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

  • 37.

    Феттер К., Ван Уайлдер В., Мошелион М., Шомон Ф .: Взаимодействия между аквапоринами плазматической мембраны модулируют активность их водных каналов.Растительная клетка. 2004, 16: 215-228. 10.1105 / tpc.017194.

    PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

  • Перейти к основному содержанию Поиск