Работа выполнена в строгом соответствии с рекомендациями комитета по уходу и использованию животных Университета Калгари.Все процедуры были одобрены этим комитетом и подробно описаны в институциональных протоколах M11002 и M11032. Были предприняты все усилия, чтобы устранить или свести к минимуму страдания. Хирургические процедуры использовали анестезию изофлураном на уровне подавления рефлекса (5% индукция, ~2% поддержание) и послеоперационный анальгетик бупренорфин (IP 0,1 мг/кг). В качестве конечных точек животных подвергали глубокой анестезии с использованием изофлюрана и обезглавливали с помощью гильотины для грызунов либо для подготовки ткани к экспериментам с острыми срезами головного мозга, либо после завершения визуализации.

Мы исследовали способность TIMAHC обнаруживать слабые или яркие физиологические сигналы от остро изолированной ткани. Острые изолированные срезы головного мозга (полученные, как описано ранее [28]) были получены от трансгенных мышей Cre-Lox, у которых специфический для астроцитов промотор GLAST (JAX #012586) вызывал cre-зависимую экспрессию генетически кодируемого индикатора Ca2+ GCaMP3 (JAX #014538). (рис. 10а, б). Благодаря использованию гемизиготных мышей GCaMP3 и низкому сигналу GCaMP3 при уровнях Ca2+ в покое [29] мы наблюдали слабую базальную флуоресценцию в астроцитах при изображении при 940 нм (значения серого 13.3+/-0,5) по сравнению с SR-101 (серые значения 137,5+/-0,8). Тем не менее, TIMAHC зафиксировал спонтанные микродоменные переходные процессы Ca2+ в тонких отростках астроцитов с отличным соотношением сигнал/шум (ΔF/F = 142,1+/−16,6, исходное SD = 1,2, n = 8, рис. 10b, c). Чтобы изучить яркий сигнал, мы электрически вызывали транзиенты Ca2+ в астроцитах и ​​нейронах, используя концентрический биполярный стимулирующий электрод (FHC) и стимулятор Grass S88X. Это было выполнено на срезах мозга, взятых у крыс Sprague Dawley (p25). Срезы массово загружали Rhod-2/AM (10 мкМ, 0.1% ДМСО, 0,05% плюроновая кислота, инкубация 45 мин при 34°С). Rhod-2 — синтетический индикатор Ca2+ с большим динамическим диапазоном, более ярким сигналом покоя, но с близким Kd по сравнению с GCaMP3 [29]. Мы возбудили Rhod-2 на длине волны 850 нм и обнаружили, что краткая электрическая стимуляция (1 с, 50 ​​Гц при 1,6 В) афферентных аксонов вызывает большие транзиенты Ca2+ в нейронах неокортекса и астроцитах с небольшим фоновым шумом (ΔF/F = 213,4+/−39,5, исходный уровень). SD = 0,5, n = 6, рис. 10г, д).

Рис. 10. Характеристики микроскопа: визуализация Ca2+ в остро изолированной ткани.

A ) Двухфотонные флуоресцентные изображения срезов мозга, взятых у мышей GLAST-Cre LSL-GCaMP3. Экспрессия индикатора Ca2+ GCaMP3 в астроцитах показана колокализацией к SR-101. Дерево астроцитов обведено желтым. B ) Астроцит крупным планом показывает интересующие микродоменные области. C ) Необработанные сигналы Ca2+ из интересующих областей в B . Вставка показывает ΔF/F. D ) Нейроны и астроциты, загруженные Rhod-2/AM (серые), и артериолы, заполненные FITC-декстраном (зеленые) в неокортексе.Показаны интересующие регионы. E ) Необработанные сигналы Ca2+, обнаруженные в интересующих областях D, в ответ на 1-секундную электрическую стимуляцию афферентных волокон частотой 50 Гц. Вставка показывает ΔF/F.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110475.g010

Чтобы проверить, насколько глубоко TIMAHC может отображать ткани с высоким светорассеянием, мы провели анализ зависимости глубины от мощности возбуждения в коре головного мозга мыши в vivo . Для равномерной концентрации флуорофора по всей глубине ткани в хвостовую вену вводили ФИТЦ-декстран (7 мг в 0.15 мл лактата Рингера) у мышей p35 C57Bl/6 с имплантированным черепным окном [30]. Используя объектив Nikon 16X 0,8NA, TIMAHC зафиксировал изображение кортикальной микрососудистой сети размером ∼725 ² мкм (рис. 11a, b). На поверхности мозга средняя мощность возбуждения составила 1,2 мВт на длине волны 780 нм. На глубине TIMAHC визуализировал до 960 мкм при средней мощности возбуждения 204,6 мВт на длине волны 780 нм до тех пор, пока фоновый сигнал почти не сравнялся с сигналом, исходящим от микроциркуляторного русла (значение капиллярного серого: 75. 89+/-0,74, значение серого фона: 65,33+/-1,0, соотношение 1,16, n = 5). На меньших глубинах TIMAHC также визуализировал клетки Ca2+ (астроциты, загруженные Rhod-2/AM) в большом поле зрения в пределах краниального окна (рис. 11c). С помощью объектива Zeiss 40X NA1.0 мелкие клеточные структуры, такие как небольшие проникающие артериолы, капилляры и отростки астроцитов, можно было четко визуализировать в узком поле зрения в vivo (рис. 11d).

Рис. 11. Характеристики микроскопа: В vivo Глубина в зависимости от мощности и визуализация Ca2+ в широком и малом полях.

A ) Демонстрация зависимости глубины изображения от мощности. Микрососуды заполнены FITC-декстраном. Четыре стековых изображения максимальной интенсивности толщиной 50 мкм, полученные на разной глубине неокортекса мыши с использованием объектива Nikon 16X 0,8NA, от поверхности мозга до 950 мкм. B ) Полный стек 3D-объемов с максимальной глубиной 960 мкм (с вычитанием фона). Слева показаны секции стека, показанные в A . Справа показана глубина изображения в зависимости от средней мощности возбуждения при 780 нм. C ) Широкоугольное изображение Ca2+ с объективом Nikon 16X NA0,8. Астроциты массово нагружали Rhod-2/AM. D ) Визуализация Ca2+ в ближнем поле. Показана одиночная проникающая артериола, капилляры (зеленый цвет), концевая ножка астроцита и отростки (серый цвет) с использованием объектива Zeiss 40X NA1.0.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110475.g011

Затем мы протестировали использование TIMAHC для визуально контролируемого накладного зажима. Либо система светодиодов и камер использовалась для некогерентного патчирования NIR (рис.12a) или клетки были нацелены на двухфотонный патч-клэмп [31] (Fig. 12b). Мы использовали стандартный внутренний раствор K-глюконата, содержащий 100 мкМ гидразида натрия Alexa 488 (Life Technologies, A-10436), используя методы, описанные ранее [28]. ФЭУ нижнего столика, который собирает передаваемый сигнал от ткани, использовался для облегчения двухфотонного наведения, позволяя визуализировать пипетку с пластырем и саму клетку-мишень (рис. 12b). Это позволяет зафиксировать немеченую клетку или флуоресцирующую клетку без необходимости флуоресцентной молекулы в пипетке для заплаты (но показано здесь с красителем, чтобы продемонстрировать успешную заплату; рис.12б справа). После цельной клетки могут быть выполнены записи отдельных клеток и исследования флуоресценции (рис. 12c).

Рис. 12. Работа микроскопа: накладной зажим с визуальным контролем.

A ) Изображение, переданное с помощью NIR-светодиода и камеры остро изолированных срезов неокортекса головного мозга (слева) и гиппокампа (справа). B ) Передаваемое изображение ткани, созданное лучом Ti:Sapph, полученное на ФЭУ под предметным столиком. Патч-пипетку и клетки можно визуализировать (слева).Успешный патч показан с заполнением Alexa 488 (справа). C ) Пэтч-кламп цельноклеточного коркового пирамидного нейрона (слева) и астроцита (справа), каждый из которых подвергался диализу со стандартным внутренним раствором K-глюконата, содержащим 100 мкМ Alexa-488 (зеленый). Изображения отображаются в виде максимальной проекции для захвата клеток и пипетки.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110475.g012

ФЭУ под столиком предлагает несколько других преимуществ при стандартном захвате флуоресцентного сигнала.Во-первых, небольшие синхронные флуктуации сигнала были обнаружены при сравнении флуоресценции и сбора в проходящем свете (корреляция r = 0,89, стандартное отклонение зеленого излучения: 0,91+/−0,10, стандартное отклонение пропускаемого сигнала: 0,85+/−0,17, n = 5, рис. 13а– в). Этот коррелированный шум не был результатом электронного шума, поскольку сигналы, генерируемые батареей на 1,5 В, питающей каждый канал, не имели корреляции (r = −0,015+/−0,36, n = 3) и были близки к нулю SD, и, таким образом, вероятно, результате небольших колебаний мощности возбуждения. Примечательно, что соотношение зеленой флуоресценции и переданного сигнала может значительно уменьшить базовый шум (отношение зеленый / транс: 0, 35 +/- 0, 07, n   =   5, p   =   0,002 по сравнению с SD зеленой флуоресценции, рис. 13c). Во-вторых, в изолированной ткани в течение более длительного периода времени мы заметили другую корреляцию, проявляющуюся в виде небольших волнистостей, возникающих как при флуоресценции (астроциты, загруженные SR-101), так и при пропускании (рис. 13d, e). Чтобы изучить эту более медленную связь, мы объединили данные за 5 с, чтобы удалить синхронный шум, наблюдаемый при 1 Гц выше (рис.13а–в). После бинирования два канала по-прежнему имели высокую корреляцию (r = 0,86+/−0,06, n = 5, вставка на рис. 13f), и использование соотношения уменьшило волнистость сигнала (SR-101 SD = 2,65+/−0,5, отношение СР-101/Транс SD = 1,73+/−0,5, p = 0,004, рис. 13е). Эти данные показывают, что передаваемый канал можно использовать для обнаружения небольших оптических изменений в ткани, которые могут влиять на флуоресценцию. Это может помочь экспериментатору понять, является ли небольшое изменение, например, показателя Ca2+ результатом изменения Ca2+ или результатом изменения оптических свойств ткани.В-третьих, визуализируя ткань с помощью коэффициента пропускания, можно зафиксировать грубые структуры, морфологию/площадь клеток или, как показано здесь, изменения диаметра кровеносных сосудов (рис. 13g). Наконец, ФЭУ на нижней стадии на TIMAHC можно использовать для изучения внутренних оптических сигналов от ткани, таких как сигналы, генерируемые увеличением синаптической активности [32] (рис. 13h) или патологическими событиями, такими как распространяющаяся депрессия [33] (рис. 13и).

Рис. 13. Характеристики микроскопа: канал передачи под предметным столиком.

A ) Просвечиваемое изображение (слева) и зеленая флуоресценция (справа) стандартного образца Convallaria . B ) Кривые, показывающие быстрый коррелированный шум между зеленым и передаваемым каналом. Соотношение двух сигналов устраняет синхронный шум и уменьшает SD в сигнале. C ) Сводная гистограмма. На вставке показана корреляция между зеленым и передаваемым сигналом r = 0,89. D ) Кривые, показывающие медленные коррелированные колебания между красным (SR-101) и передающим каналом в изолированной ткани, полученные из области, показанной на E .Соотношение SR-101/Trans в значительной степени устраняет волнистость и уменьшает стандартное отклонение для 5-секундных группированных данных, обобщенных в F . На вставке показана корреляция между красным и передаваемым сигналом для 5-секундных группированных данных (r = 0,97). G ) Передаваемые изображения небольшой артериолы до (слева) и после вазоконстрикции (справа), вызванной агонистом рецептора тромбоксана U46619 (200 нМ). Внутренние оптические сигналы (IOS), захваченные ФЭУ на нижней стадии в ответ на синаптическую активность ( H ) и волну распространяющейся депрессии (SD) ( I ).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110475.g013

Альтернативные сборки

TIMAHC можно легко адаптировать, расширить или упростить. Мы предлагаем четыре дополнительные модели в качестве примеров модификаций TIMAHC: 1) сборка с расширенной оптикой стола и кинематической сборкой, так что TIMAHC может принимать два лазерных луча; 2) уменьшенная сборка для в исследованиях vivo , в которой нет NIR-камеры или подсценической оптики; 3) включение быстродействующего затвора в сборочный узел детектора для блокировки ФЭУ во время комбинированных экспериментов по двухфотонной визуализации и фотостимуляции видимым светом, когда флуорофор имеет спектры излучения, перекрывающиеся со светом возбуждения, и 4) сборка микроскопа. позвоните в IMEPS, что означает «Инфракрасный микроскоп для электрофизиологии и фотостимуляции».IMEPS не предназначен для двухфотонной флуоресцентной визуализации и, следовательно, не нуждается в соединении с дорогостоящим Ti:Sapph лазером. Однако можно получить переданное изображение ткани с помощью простого диодного лазера NIR (Thorlabs, номер по каталогу CPS192), гальванометрических сканеров и ФЭУ под столиком. Гальванометрические сканеры также можно использовать для выбора областей для фотоактивации видимой лазерной линией, которая будет контролироваться затвором и/или ячейкой Поккеля. Кроме того, заменив вышеописанные ФЭУ светодиодами, можно было бы осуществлять точечную фотостимуляцию в центре поля зрения при различных размерах светящихся точек.Обратите внимание, что эти альтернативные сборки не были полностью протестированы, и подробные детали и прайс-листы не предоставляются (модель S2).

Изображение и статистический анализ

Весь анализ изображений был выполнен с использованием программы обработки с открытым исходным кодом ImageJ. Статистический анализ, который включал t-тесты (парные и непарные по мере необходимости), линейные регрессии и корреляции, выполняли с использованием программного обеспечения Graphpad Prism 5.

Осторожно

TIMAHC представлен с открытым путем луча, чтобы лучше показать сборку, но путь света должен быть закрыт для повышения безопасности с использованием линзовых трубок и пластиковых трубок (Thorlabs, детали № SM1L XX, SM2L XX и SC1L24, SC2L24) .Кроме того, хотя этот ресурс предназначен для облегчения неопытного пользователя в построении системы двухфотонной визуализации, следует подчеркнуть, что такая попытка является важным мероприятием. Ответственность за тестирование, устранение неполадок и исправление лежит на пользователе. Несмотря на то, что мы пытались дать подробные рекомендации в разделах по сборке и устранению неполадок в дополнительной информации (Приложение S1), наши усилия на этом фронте не являются исчерпывающими.

Обсуждение

В нашей лаборатории TIMAHC зарекомендовал себя как надежный исследовательский инструмент по доступной цене.TIMAHC: 1) работает близко к теоретическому пределу дифракции, 2) имеет отношение сигнал/шум, превышающее три коммерческих двухфотонных микроскопа, 3) может отображать изображения на глубине около 1 мм в мозге мыши, 4) не ухудшается хроматическая и сферическая аберрация или радиальное искажение, 5) способно отображать изображение в широком поле с использованием объективов с низким увеличением, но с высокой числовой апертурой, 6) улавливает устойчивые сигналы Ca2+ из клеточных и субклеточных компартментов и 7) может быть легко адаптировано.

Одной из наиболее важных характеристик флуоресцентного микроскопа является отношение сигнал/шум.Мы проверили это при трех различных мощностях возбуждения, сохраняя при этом постоянное максимальное значение серого пикселя, чтобы обеспечить контраст между различными системами визуализации. TIMAHC продемонстрировал отличное соотношение сигнал/шум, однако в представленном сравнении важно уточнить, что существуют переменные, которые нельзя поддерживать постоянными между различными двухфотонными системами, такими как модель объектива, модель ФЭУ (хотя Nikon A1 также имел GaAsP ФЭУ), несколько оптических элементов и сложность пути возбуждения и сбора света.Однако сравнение номинальной стоимости ценно, поскольку приравнивание всех или большинства переменных между системами сводит на нет тест. Именно общий дизайн и детали, выбранные для TIMAHC, представляли интерес для сравнения с готовыми коммерческими системами, чтобы оценить различия в производительности.

Несмотря на специальную оптическую ось на TIMAHC, состоящую из обычной сканирующей линзы и тубусной линзы, которые соединяются с различными коммерческими объективами, мы измерили разрешение, близкое к теоретическому пределу, определяемому дифракцией света. Мы также обнаружили, что система не имеет обнаруживаемых хроматических и сферических аберраций или радиальных искажений, таких как подушкообразная или бочкообразная деформация поля зрения. Отчасти это было ожидаемо, потому что большая часть характеристик изображения микроскопа зависит от числовой апертуры линзы объектива и поправок, сделанных в линзе объектива. Кроме того, сканирующая линза корректирует внеосевой свет, генерируемый сканирующими зеркалами, чтобы предотвратить деформацию плоскости фокусировки. Сканирующая линза, выбранная для TIMAHC, была разработана для имплантации в специальные установки для визуализации (Thorlabs, номер по каталогу LSM04-BB).Коммерческие тубусные линзы обычно оптимизируют парфокальность (для сохранения одной и той же плоскости изображения) в сочетании с их коммерческими целями (см. раздел «Соображения и ограничения»). Мы выбрали трубчатую линзу с большим фокусным расстоянием, чтобы свести к минимуму системные артефакты, вызванные внеосевыми лучами, а также потому, что большее фокусное расстояние повышает гибкость при добавлении оптики на световой путь.

TIMAHC визуализировал впечатляющие 960 мкм глубины коры головного мозга мыши (p35). Этот тип ткани и возраст имеют константу длины светорассеяния около 100 мкм [16], а достигаемая глубина изображения близка к теоретическому пределу для этой длины волны (780 нм) [15].Таким образом, должна быть возможна еще более глубокая визуализация с использованием более длинных длин волн для изображения красных флуоресцентных молекул, если мощность возбуждения не ограничивается [14]. Отличное соотношение сигнал-шум, геометрия собирающего светового тракта и использование объектива с малым увеличением, но с высокой числовой апертурой, вероятно, способствовали получению изображения с глубиной, близкой к 1 мм [16].

Основа конструкции TIMAHC, в которой различные узлы скользят по основной оптической направляющей, обеспечивает большую гибкость в отношении предельной высоты линзы объектива.Например, для в визуализации vivo критично только относительное положение между верхними узлами кинематики, сканирования и детектора, а не их абсолютная высота над оптическим столом. Все три подузла можно перемещать вверх или вниз по рельсу вместе, чтобы изменить распределение пространства по оси z под объективом для различных экспериментальных препаратов. Кроме того, узел конденсатора можно легко снять с направляющей, а столик для образцов можно либо отрегулировать по высоте, либо убрать его аспекты.Таким образом, практически любой исследовательский препарат можно было визуализировать за относительно короткий промежуток времени, например, кроликов, кошек или даже обезьян [34]. Даже препарат бодрствующей мыши, при котором животное выполняет бег на беговой дорожке [35], требует большого пространства под объективом. Нам неизвестно ни о каком коммерческом двухфотонном микроскопе, который мог бы вносить столь существенные изменения в геометрию, а также с относительной легкостью восстанавливать изображение образца in vitro с использованием оптики под предметным столиком.

Мы предоставляем четыре дополнительные модели 3D CAD с подробным описанием вероятных адаптаций к TIMAHC, но возможны и многие другие модификации. Во-первых, TIMAHC можно адаптировать для визуализации генерации второй гармоники. В этом сценарии мы рекомендуем переконфигурировать подсборку оптики стола и подсборку конденсора в соответствии с деталями и протоколами, описанными в другом месте [36]. Во-вторых, Ti:Sapph-лазеры могут включать или дополняться оптическим параметрическим генератором для более длинных волн и, следовательно, более глубокого изображения тканей [14].Хотя TIMAHC может выполнять визуализацию с большей длиной волны, его электрооптический модулятор и оптика оптимизированы для выхода Ti:Sapph в диапазоне 700–1100 нм. Таким образом, если волны за пределами этого диапазона будут основным подходом, мы рекомендуем выбрать более подходящую ячейку Поккеля (например, серию кристаллов LTA от Conoptics), а также зеркала и линзы с покрытиями, которые оптимизируют отражательную способность и пропускание (серебро). зеркала или покрытие Thorlabs C). Также следует убедиться, что интересующий объектив был протестирован на хорошее пропускание в расширенном диапазоне длин волн NIR. В-третьих, TIMAHC можно адаптировать для визуализации с помощью ультракоротких лазерных импульсов, чтобы можно было использовать широкую полосу спектра для одновременного возбуждения нескольких флуорофоров. Поскольку сверхкороткие импульсы сильно подвержены дисперсии, следует приобрести зеркала для компенсации дисперсии (Thorlabs, номер по каталогу DCMP175) и монтажное оборудование, а также, возможно, приборы для измерения ширины импульса.

Состоящий из оптико-механических частей и обладающий открытой архитектурой, TIMAHC может использоваться в качестве учебного пособия для продвинутой микроскопии.Например, несколько студентов, работающих с инструктором, могут построить TIMAHC как семестровый курс. Сочетание сборки, испытаний, измерений и устранения неполадок с лекциями по темам может научить многим различным принципам работы с микроскопом. Это включает в себя, но не ограничивается: основную оптику, источники света, оптический путь, сканирование, объективы, обнаружение и многие другие подробности о модальностях визуализации. Это будет экспериментальное обучение на самом высоком уровне.

Соображения и ограничения

Существует ряд вопросов для обсуждения, которые любой потенциальный человек должен рассмотреть перед использованием этого ресурса.Во-первых, TIMAHC включает в себя 5-мм сканирующие зеркала от Cambridge Tech, и, учитывая расширение луча, обеспечиваемое сканирующей линзой и трубчатой ​​линзой (3,7x), максимальный диаметр луча на задней апертуре линзы объектива составляет 18,5 мм. Таким образом, TIMAHC оптимизирован для использования объективов с задней апертурой меньше этого диаметра. Если желательны большие или меньшие максимальные диаметры луча или если требуются другие максимальные скорости сканирования, можно изменить/модифицировать несколько элементов в сканирующем подузле. Во-первых, использование сканирующих зеркал большего размера позволит увеличить диаметр луча, но снизит максимальную скорость сканирования.И наоборот, зеркала меньшего размера уменьшают максимальный диаметр луча, но обеспечивают более быстрое сканирование. Кроме того, две изготовленные на заказ детали в сканирующем подузле TIMAHC потребуют модификации, чтобы соответствовать другому креплению сканирующего зеркала, если сканирующие зеркала будут заменены. Изменение фокусного расстояния (расстояний) и, следовательно, коэффициента расширения сканирующей линзы и/или тубусной линзы также может изменить диаметр луча. Обратите внимание, что соотношение расстояний между сканирующими зеркалами, сканирующей линзой, тубусной линзой и задней апертурой объектива необходимо изменить, чтобы они соответствовали новому фокусному расстоянию (ям) [7], [8], и, таким образом, расстояния в представленной дополнительной модели не изменятся. дольше применять.

В качестве альтернативы можно сохранить конфигурацию TIMAHC и учитывать недостатки задних отверстий, превышающих 18,5 мм. Во-первых, у объектива не будет ограничений по дифракции [1], [8]. Это приемлемо, если интересует большее поле зрения, а не субмикронный масштаб. Например, мы регулярно используем объектив Nikon 16X 0,8NA (задняя апертура 20 мм) для картирования микрососудов головного мозга и локализации пространственно распределенных сигналов Ca2+ в vivo с использованием субпиксельной выборки Найквиста (1024 ² ). На самом деле, выборка Найквиста с дифракционно-ограниченной линзой с высокой числовой апертурой и малым увеличением требует очень высокой плотности пикселей и такого медленного получения кадров, что этот подход может быть непрактичным, особенно с гальванометрическими сканерами. Во-вторых, объективы с большой задней апертурой могут привести к небольшим потерям сигнала, поскольку мы используем 1-дюймовую собирающую линзу в качестве первой линзы в сборке детектора после первичной дихроичной. Это связано с тем, что испускаемая флуоресценция рассеянных небаллистических фотонов, выходящих из большой задней апертуры, может не попасть в 1-дюймовую собирающую линзу [1], [24].Однако фиксированный короткий путь сбора TIMAHC предназначен для минимизации потерь сигнала. Полученная глубина изображения (960 мкм) предполагает, что 1-дюймовая коллекторная линза не является серьезным ограничением. Наконец, парфокальное расстояние между разными объективами (например, между объективами с высокой числовой апертурой и резко различающимися увеличениями) может быть настолько значительным, что диапазон в 1 дюйм на ползунке z не позволяет использовать обе линзы на данной высоте предметного столика. Либо предметный столик и высоту конденсора можно сконфигурировать и оптимизировать для конкретного объектива, либо можно добавить удлинительные кольца (Thorlabs, артикул № SM1L XX ) к более коротким объективам для выравнивания парфокального расстояния.

Для сканирующего оборудования TIMAHC мы рекомендуем определенные максимальные скорости двунаправленного сканирования при определенных коэффициентах масштабирования (или, скорее, при определенных углах сканирования), чтобы не превышать возможности системы. Тестируя устойчивую стабильность сканирования на различных скоростях, мы обнаружили, что стабильное изображение достигается, когда не превышаются следующие значения: масштабирование 1 при 2 мс/строку, масштабирование 1,3 при 1 мс/строку, масштабирование 3,5 при 0,5 мс/строку, масштабирование 10 при 0,25. мс/строка (данные не показаны). Все эти настройки удерживают силу тока, потребляемую платой сервосканирования, ниже нуля.75 ампер на канал, что позволяет избежать искажений при сканировании.

Мы используем стандартный ахроматический трубчатый объектив с большим фокусным расстоянием (200 мм) (Thorlabs, номер по каталогу AC508-200-B). При использовании коммерческого объектива, не предназначенного для тубуса, передаваемое изображение, генерируемое светодиодом под столиком, не будет парфокальным с двухфотонным изображением. При использовании погружного объектива 40X 1.0NA от Zeiss мы обнаружили, что эти две плоскости изображения смещены друг относительно друга примерно на 150 микрон.Это легко преодолеть, перемещая линзу объектива на это расстояние по оси z при переключении со светодиодного изображения в проходящем свете на двухфотонное изображение или наоборот. Важно отметить, что в TIMAHC используется универсальная тубусная линза, поэтому мы можем выбрать лучший коммерческий объектив, доступный для конкретной экспериментальной задачи, и нам не нужно оставаться верным конкретному бренду.

Количество флуоресцентных детекторов и связанных с ними оптических/аппаратных средств можно увеличить, но необходимо учитывать вес ползунка моторизации z. Для большего количества каналов флуоресценции рекомендуется другая конструкция, в которой блок детектора крепится к основной оптической направляющей (с сохранением оптической оси), а не непосредственно к приводу z. При последовательном добавлении флуоресцентных детекторов к сборке фокусные расстояния линз в сборочной сборке детектора должны измениться, чтобы должным образом сфокусировать излучаемую флуоресценцию на каждом ФЭУ [7].

При использовании этого ресурса необходимо учитывать соотношение стоимости и времени.Хотя экономия затрат на TIMAHC может легко превысить 150 тысяч долларов США для сопоставимого двухфотонного микроскопа, требуется значительное время для сборки и, в некоторых случаях, устранения неполадок. Например, одному-двум опытным людям (непосредственно или технически склонным) потребуется две-три недели, чтобы создать оптимизированную систему. При небольшом опыте одному-двум людям может понадобиться пара месяцев. Кроме того, трудно предсказать, какие действия по устранению неполадок потребуются, что может затянуть процесс. Мы представили как можно больше потенциальных проблем и решений в дополнительных материалах, чтобы ускорить процесс окончательной доработки (Приложение S1). Также необходимо учитывать время выполнения определенных деталей для TIMAHC. Ti:Sapph-лазер, флуоресцентная оптика и GaAsP-ФЭУ имеют самое длительное время разработки (до нескольких месяцев), но это сравнимо со временем разработки полных коммерческих систем.

Дополнительная информация

Рисунок S1.

Вспомогательное приспособление для выравнивания монтажа узла извещателя. Крупный план детекторного узла (ФЭУ и объектив сняты) и нижней части сканирующего узла. Детали, окрашенные в синий цвет (CP02, ER6 x 2, LCP02), предназначены для облегчения выравнивания при монтаже. Чтобы добавить средство для выравнивания, тубусную линзу следует снять со сканирующего узла. Нижняя часть пластины CP02 должна касаться верхней части первичного дихроичного куба так, чтобы задняя апертура объектива находилась примерно в 200 мм от середины тубусной линзы. Важно отметить, что это положение соответствует тому, что ползунок z опущен почти до конца (положение визуализации, а не когда линза объектива поднята для загрузки ткани или доступа пипетки).Инструмент необходим для установки узла детектора на уровне оптической оси и под нужным углом, чтобы создать пространство для доступа микроманипулятора к ванне для тканей.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110475.s001

(TIF)

Модель S1.

Предоставляется трехмерная CAD-модель всего микроскопа, включая отдельные модели для каждого из узлов, составляющих полный узел. Можно визуализировать точное положение и ориентацию каждой детали в сборке.Модели просматриваются в SolidWorks eDrawings (бесплатное программное обеспечение для загрузки в Интернете) или непосредственно в SolidWorks.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110475.s004

(ZIP)

Модель S2.

Четыре альтернативные сборки или модификации TIMAHC предоставляются в виде 3D-моделей CAD. К ним относятся 1) упрощенная модель только для в приложениях vivo , 2) модель, в которой TIMAHC может принимать два луча, например, для экспериментов по визуализации и стимуляции видимой линии, 3) альтернативный блок детектора с быстрым затвором для защиты ФЭУ во время фотоактивации видимым светом и 4) вызов сборки микроскопа IMEPS, который не используется для флуоресцентной визуализации, а вместо этого используется для инфракрасной микроскопии в сочетании с электрофизиологией и фотостимуляцией.Каждая альтернативная сборка содержит полную модель, а также отдельные модели для каждого узла, содержащегося в полной сборке. Модели просматриваются в SolidWorks eDrawings (бесплатное программное обеспечение для загрузки в Интернете) или непосредственно в SolidWorks.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110475.s005

(ZIP)

Благодарности

Мы благодарим доктора Брайана Маквикара из Университета Британской Колумбии за поддержку первоначальной разработки TIMAHC в его лаборатории. Спасибо д-ру Роджеру Томпсону, визуализацию которого провел Николас Вейлингер, за возможность сбора данных отношения сигнал-шум на многофотонном микроскопе Leica SP5 II. Спасибо Крейгу Бридо из лаборатории доктора Питера Стайса за помощь в сборе данных отношения сигнал-шум на многофотонном микроскопе Nikon A1. Спасибо докторам. Пине Коларуссо и Катажине Стивенс за помощь в сборе данных отношения сигнал-шум на их многофотонной системе Olympus FV300. Мы также признательны разработчикам и распространителям программного обеспечения ScanImage с открытым исходным кодом: лаборатории Карела Свободы в Janelia Farms и лаборатории Гордона Шеперда в Northwestern, а также предыдущим первоначальным разработчикам в лабораториях Cold Spring Harbour Laboratories.Мы также благодарим Виджая Айера из Janelia Farms, ключевого разработчика и контактного лица по вопросам программного обеспечения.

Авторские взносы

Задумал и разработал эксперименты: DR CT JL NZ GG. Выполнены опыты: ДР КТ ГГ. Проанализированы данные: ДР КТ ГГ. В написании рукописи участвовали: DR CT JL NZ GG.

Каталожные номера

1. 1. Helmchen F, Denk W (2005)Двухфотонная микроскопия глубоких тканей. Nat Methods 2: 932–940
2. 2. So PT, Dong CY, Masters BR, Berland KM (2000) Двухфотонная флуоресцентная микроскопия возбуждения.Annu Rev Biomed Eng 2: 399–429
3. 3. Denk W, Strickler JH, Webb WW (1990)Двухфотонная лазерная сканирующая флуоресцентная микроскопия. Наука 248: 73–76.
4. 4. Soeller C, Cannell MB (1996)Конструирование двухфотонного микроскопа и оптимизация длительности импульса освещения. Арка Пфлюгера 432: 555–561.
5. 5. Konig K, Simon U, Halbhuber KJ (1996) Трехмерная двухфотонная флуоресцентная микроскопия живых клеток с использованием модифицированного конфокального лазерного сканирующего микроскопа.Cell Mol Biol (Noisy-le-grand) 42: 1181–1194.
6. 6. Mainen ZF, Maletic-Savatic M, Shi SH, Hayashi Y, Malinow R, et al. (1999) Двухфотонная визуализация в срезах живого мозга. Методы 18: 231–9–181.
7. 7. Цай П.С., Нисимура Н., Йодер Э.Дж., Уайт А., Дольник Э. и др. (2002) Принципы, дизайн и конструкция двухфотонного сканирующего микроскопа для исследований in vitro и in vivo. В методах оптической визуализации функций мозга in vivo, Фростиг Р. (2002). КПР Пресс.113–171.
8. 8. Зипфель В.Р., Уильямс Р.М., Уэбб В.В. (2003) Нелинейная магия: многофотонная микроскопия в биологических науках. Nat Biotechnol 21: 1369–1377
9. 9. Ким К.Х., Бюлер С., Со П.Т. (1999) Высокоскоростной двухфотонный сканирующий микроскоп. Заявка Опция 38: 6004–6009.
10. 10. Nguyen QT, Callamaras N, Hsieh C, Parker I (2001)Конструирование двухфотонного микроскопа для визуализации Ca(2+) со скоростью видео. Клеточный кальций 30: 383–393.
11. 11. Jiang R, Zhou Z, Lv X, Zeng S (2012)Широкополосные акустооптические дефлекторы для двухфотонного микроскопа с большим полем зрения. Rev Sci Instrum 83: 043709
12. 12. Tan YP, Llano I, Hopt A, Wurriehausen F, Neher E (1999) Быстрое сканирование и эффективное фотодетектирование в простом двухфотонном микроскопе. J Neurosci Methods 92: 123–135.
13. 13. Дрисколл Дж. Д., Ших А. И., Айенгар С., Филд Дж. Дж., Уайт Г. А. и др. (2011) Подсчет фотонов, цензурные поправки и визуализация времени жизни для улучшения обнаружения в двухфотонной микроскопии. Дж. Нейрофизиол 105: 3106–3113
14. 14. Кобат Д., Хортон Н.Г., Сюй С. (2011)Двухфотонная микроскопия in vivo до 1.Глубина 6 мм в коре головного мозга мыши. J Biomed Opt 16: 106014
15. 15. Theer P, Hasan MT, Denk W (2003)Двухфотонная визуализация на глубину 1000 микрон в живом мозге с использованием регенеративного усилителя Ti:Al2O3. Opt Lett 28: 1022–1024.
16. 16. Oheim M, Beaurepaire E, Chaigneau E, Mertz J, Charpak S (2001)Двухфотонная микроскопия в тканях головного мозга: параметры, влияющие на глубину изображения. J Neurosci Methods 111: 29–37.
17. 17. Николенко В., Юсте Р. (2013) Как построить двухфотонный микроскоп с конфокальной сканирующей головкой.Протокол Cold Spring Harb 2013.
18. 18. Диаспро А., Коросу М., Рамойно П., Робелло М. (1999) Адаптация системы компактного конфокального микроскопа к архитектуре флуоресцентной визуализации с двухфотонным возбуждением. Microsc Res Tech 47: 196–205
19. 19. Wier WG, Balke CW, Michael JA, Mauban JR (2000) Изготовленный на заказ конфокальный и двухфотонный цифровой лазерный сканирующий микроскоп. Am J Physiol Heart Circ Physiol 278: h3150–h3156.
20. 20. Маевска А., Ю Г., Юсте Р. (2000) Изготовленный на заказ двухфотонный микроскоп и система деконволюции.Арка Пфлюгера 441: 398–408.
21. 21. Пологруто Т.А., Сабатини Б.Л., Свобода К. (2003) ScanImage: гибкое программное обеспечение для работы с лазерными сканирующими микроскопами. Биомед Инж Онлайн 2: 13
22. 22. Лангер Д., Ван ‘т Хофф М., Келлер А.Дж., Нагарая С., Пфаффли О.А. и др. (2013) HelioScan: программная среда для управления установками микроскопии in vivo с высокой аппаратной гибкостью, функциональным разнообразием и расширяемостью. J Neurosci Methods 215: 38–52
23. 23. Nguyen QT, Tsai PS, Kleinfeld D (2006) MPScope: универсальный программный пакет для многофотонной микроскопии.J Neurosci Методы.
24. 24. Beaurepaire E, Mertz J (2002)Коллекция эпифлуоресценции в двухфотонной микроскопии. Appl Opt 41: 5376–5382.
25. 25. Петтит Д.Л., Ван С.С., Джи К.Р., Августин Г.Дж. (1997) Химическое двухфотонное освобождение от клеток: новый подход к картированию рецепторов глутамата. Нейрон 19: 465–471.
26. 26. Коской С., Вахарт Ф., Готро А., Мартин М., Лувар Д. и др. (2002) Молекулярный анализ микроскопической динамики эзрина с помощью двухфотонного FRAP.Proc Natl Acad Sci USA 99: 12813–12818
27. 27. Коул Р. В., Джинадаса Т., Браун К.М. (2011)Измерение и интерпретация функций разброса точек для определения разрешения конфокального микроскопа и обеспечения контроля качества. Нацпроток 6: 1929–1941
28. 28. Gordon GRJ, Iremonger KJ, Kantevari S, Ellis-Davies GCR, MacVicar BA, et al. (2009)Опосредованная астроцитами распределенная пластичность в гипоталамических глутаматных синапсах. Нейрон 64: 391–403
29. 29. Tian L, Hires SA, Mao T, Huber D, Chiappe ME, et al.(2009)Визуализация нейронной активности у червей, мух и мышей с улучшенными показателями кальция GCaMP. Nat Methods 6: 875–881
30. 30. Холтмаат А., Бонхёффер Т., Чоу Д.К., Чакоури Дж., Де Паола В. и др. (2009)Долговременная визуализация с высоким разрешением неокортекса мыши через хроническое черепное окно. Nat Protoc 4: 1128–1144
31. 31. Китамура К., Юдкевитц Б., Кано М., Денк В., Хойссер М. (2008) Целевые записи патч-зажимов и одноклеточная электропорация немеченых нейронов in vivo. Nat Methods 5: 61–67
32. 32. MacVicar BA, Hochman D (1991)Визуализация синаптически вызванных внутренних оптических сигналов в срезах гиппокампа. J Neurosci 11: 1458–1469.
33. 33. Zhou N, Gordon GRJ, Feighan D, MacVicar BA (2010)Временное набухание, закисление и митохондриальная деполяризация происходят в нейронах, но не в астроцитах во время распространяющейся депрессии. Кора головного мозга 20: 2614–2624
34. 34. Heider B, Nathanson JL, Isacoff EY, Callaway EM, Siegel RM (2010)Двухфотонная визуализация кальция в трансфицированных вирусом полосатых кортикальных нейронах обезьяны.PLoS ONE 5: e13829
35. 35. Домбек Д.А., Хаббаз А.Н., Коллман Ф., Адельман Т.Л., Танк Д.В. (2007)Визуализация крупномасштабной нейронной активности с клеточным разрешением у бодрствующих подвижных мышей. Нейрон 56: 43–57
36. 36. Chen X, Nadiarynkh O, Plotnikov S, Campagnola PJ (2012)Микроскопия генерации второй гармоники для количественного анализа фибриллярной структуры коллагена. Нацпроток 7: 654–669

границ | Методология испытаний роботизированного манипулятора на радиационную устойчивость перед обращением с ядерными отходами

1.Введение

Ядерная промышленность в Великобритании и во всем мире все чаще ищет экономически эффективные методы для внедрения удаленных технологий, позволяющих вывести из эксплуатации устаревшие установки по обработке и обращению с отходами для снижения остаточной опасности, практика, настоятельно рекомендованная Международным агентством по атомной энергии (Iqbal et al., 2012). В то время как современные роботы повсеместно используются в других отраслях, таких как производство, в атомной промышленности еще предстоит добиться значительного внедрения, что принесло бы большую пользу от более широкого использования робототехники, если бы они были реализованы для выполнения работы, слишком опасной или сложной для людей. рабочие.На старых ядерных объектах требуются удаленные операции для целей инспекции, определения характеристик, резки, демонтажа, сортировки и разделения опасных отходов перед сносом зданий. Опасности, обычно встречающиеся на старых ядерных объектах, включают агрессивные химические вещества, радиоактивные материалы, излучающие альфа-, бета- или гамма-излучение, и асбест. Часто перед выводом из эксплуатации требуется понимание характера и распределения этих типов опасностей, и поэтому обеспечение этой улучшенной ситуационной осведомленности и возможности выполнять задачи удаленно — это то, где новые роботизированные технологии могут принести пользу отрасли.

Консервативная нормативно-правовая база и высокие стандарты безопасности заставляют операторов атомных станций консервативно подходить к внедрению новых технологий, поэтому перед использованием любые новые системы должны быть продемонстрированы и тщательно протестированы в моделируемой среде. Многие объекты, вышедшие из эксплуатации, были построены в 1950-60-х годах по простой, но эффективной технологии.

Использование простых удаленных систем не является чем-то новым для отрасли, но внедрение было медленным и ограниченным: Houssay (2000) описывает несколько уже опробованных систем, в том числе для рутинного мониторинга и наблюдения в Саванна-Ривер в США, а также для очистки пара. генераторы на электростанции в Индиан-Пойнт-2 еще в 1989 году.

Современная электроника позволяет более разумно использовать роботизированные системы, но это сопряжено со своими проблемами. Многие в отрасли считали, что радиация немедленно выводит из строя любые современные электронные компоненты, поэтому электроники обычно избегали. Известно, что несколько роботов, использовавшихся для исследования активной зоны реактора Фукусима-дайити, подверглись чрезвычайно высоким дозам облучения, что привело к их очень быстрому выходу из строя. Такие экстремальные значения радиации не являются обычным явлением в области вывода из эксплуатации ядерных объектов, и поэтому эта статья направлена ​​на то, чтобы бросить вызов общепринятому мнению о том, что радиация и электроника несовместимы.В текущей работе мы демонстрируем, что электронные технологии действительно можно использовать в радиоактивных средах с успешными результатами. Представление о том, что «никакое электронное оборудование не может выдержать радиацию» и, следовательно, его нельзя использовать ни для каких задач по выводу из эксплуатации, неверно, и наши эксперименты с использованием высокоактивного источника излучения на основе кобальта-60 показали, что полезную работу можно выполнять с помощью сложных роботов.

Радиационная устойчивость многих электронных компонентов, безусловно, имеет первостепенное значение для функциональности роботов (Garg et al., 2006). Часто исследователи или производители пытались сделать свои электронные устройства более устойчивыми к излучению, изменяя конструкцию интегральных схем, увеличивая амплитуду сигнала или просто экранируя (Ferlet-Cavrois, 2011). Однако в некоторых случаях наиболее экономичным решением для использования электроники в радиоактивных средах является использование стандартных компонентов и планирование их замены. Ясно, что есть случаи, когда замена невозможна (например, космические исследования или долгосрочная установка в резервуар для переработки), однако, понимая условия воздействия, создаваемые каждым приложением, и требуемый срок службы компонентов, можно разработать соответствующие решения. .Центральное место в оценке каждого приложения занимает знание устойчивости к излучению каждого компонента, а также системы в целом.

Многие испытания электронных компонентов на облучение исследуют отдельные интегральные схемы или микросхемы (например, работа Katz and Some, 2003; Nagatani et al. , 2011; Ducros et al., 2017), в то время как наше испытание было направлено на проверку всей роботизированной системы. руку, чтобы лучше имитировать то, что может произойти в реальной промышленной среде, содержащей высокорадиоактивный материал.Предлагается методология планирования экспериментов по оценке производительности системы промышленного робота при выполнении роботом динамической задачи. Таким образом, можно наблюдать деградацию роботизированной системы во время ее работы, и поэтому тест обеспечивает более содержательную оценку эксплуатационных проблем по сравнению с оценкой производительности, проводимой на отдельных компонентах или когда робот неподвижен.

Это самая первая работа, в которой оценивается системная производительность серийного промышленного робота-манипулятора.Производителям не было ясно, будет ли KUKA iiwa LBR800 работать вообще при тех же уровнях радиации, что и на объектах, работающих с отходами средней активности (ILW). В этой статье мы описываем эксперимент по проверке радиационной устойчивости робота-манипулятора в качестве исследовательского теста для определения серийной радиационной устойчивости такой системы и понимания того, какие улучшения можно было бы внести, чтобы повысить ее пригодность для вывода из эксплуатации. Приложения.

2. Методика оценки производительности промышленных роботов

Роботизированные системы, содержащие электронные компоненты, могут быть повреждены в той или иной форме, вызывая изменение функциональности при воздействии радиации, и этот эффект будет зависеть от дозы облучения. Для многих задач вывода из эксплуатации материалы, испускающие излучение, не будут четко определены, поэтому измерение мощности дозы в окружающей среде вполне может быть одной из задач роботизированной инспекции.

Воздействие радиации на компоненты зависит от материала и хорошо изучено.Металл-оксид-полупроводники (МОП) имеют измененные электронные свойства (Ma and Dressendorfer, 1989), эластомерные материалы, используемые в уплотнениях, могут становиться хрупкими (Wündrich, 1984), а оптические компоненты, как известно, со временем изменяют свою прозрачность и показатели преломления (Brichard). и др., 2001). Изменения в величине измеренных ошибок в моторном контроле наблюдали Howard et al. (2018). При достаточном излучении эти изменения механических, оптических или электронных свойств могут в конечном итоге привести к выходу из строя восприимчивых компонентов, что потенциально может привести к поломке робота.

Воздействие радиации на роботизированную систему может зависеть от ее рабочего состояния, а «стационарный» метод оценки может не демонстрировать изменения производительности всей системы. Для систем, работающих в динамическом движении, крайне важно гарантировать производительность системы всего робота (Aitken et al., 2018; Tsitsimpelis et al., 2019), чтобы робот мог выполнять свои задачи для конкретной миссии. Недавно были предложены различные готовые промышленные роботы, например, iiwa 14 LBR820, предложенный Aitken et al.(2018 г.) и прототипы систем, финансируемые Управлением по выводу из эксплуатации ядерных установок Великобритании (2019 г.). Развертывание готовых роботов избавляет от необходимости разрабатывать и производить специальные роботы-манипуляторы для конкретных требований, ускоряя развертывание на ядерных объектах, но большинство готовых промышленных роботов не испытывали в радиационной среде. Для соблюдения строгих нормативных требований и для создания аргументов в пользу безопасности важно квалифицировать работу системы промышленного робота-манипулятора во время воздействия радиоактивных материалов, чтобы снизить риск аварии.

В этом документе предлагается систематическая методология оценки производительности промышленного робота, состоящая из следующих шагов:

1. Определение критических мест в манипуляторе, содержащих (часто электронные) компоненты, потенциально подверженные радиационному облучению.

2. Планирование движения робота для конкретных приложений с учетом любых ограничений безопасности и физических ограничений.

3. Измерение мощности экспозиционной дозы в каждой критической точке.

4. Сбор данных и контроль работоспособности имеющихся параметров и показателей при повторяющемся движении по заданной траектории под воздействием радиации.

5. После наблюдаемого снижения производительности оценка точки отказа с использованием «стационарного» метода.

Шаг 1. Из-за высокой сложности готовых промышленных роботов часто бывает очень сложно создать аналитические модели систем, на которые может влиять радиация (Howard et al., 2018). Тем не менее, можно определить компоненты, которые наименее устойчивы к радиации, и оценить их аварийную дозу путем испытаний на облучение отдельных компонентов. Как правило, управляющие процессоры и интегральные схемы (ИС) датчиков считаются наименее радиационно стойкими компонентами по результатам стационарных оценок (Katz and Some, 2003; Nagatani et al., 2011; Ducros et al., 2017). ). Также может быть необходимо учитывать деградацию других материалов, таких как эластомерные полимеры (для структурной целостности; Wündrich, 1984) и оптические волокна (для связи между устройствами; Brichard et al., 2001).

Этап 2. Необходимо провести оценку промышленного робота в радиационной среде с требуемой мощностью дозы в течение заданного времени воздействия (Katz and Some, 2003; Nagatani et al., 2011; Ducros et al. , 2017; Tsitsimpelis et al. , 2019). Этого легко добиться при обычных стационарных оценках, поскольку отдельные электронные компоненты могут подвергаться воздействию постоянной мощности дозы. Для более точного моделирования реальной работы мы рекомендуем использовать динамический тест, в котором робот выполняет повторяющиеся движения, предоставляя убедительные доказательства того, с какими видами отказов можно столкнуться во время реальной работы.Сравнение рабочих параметров, собранных во время каждого цикла повторяющихся действий в периоды воздействия и до воздействия, можно использовать для отображения или прогнозирования изменений в производительности робота. Траектория робота должна обходить препятствия в случае неисправности, особенно с радиоактивными источниками.

Шаг 3. На практике мощность экспозиционной дозы варьируется в зависимости от близости каждого компонента робота к источнику излучения, и различия могут быть значительными. Важно точно измерить мощность дозы в представляющих интерес местах, особенно в менее устойчивых к радиации компонентах, чтобы характеристики можно было соотнести с дозой облучения. Мощность дозы в каждом положении следует измерять в течение нескольких динамических рабочих циклов, для чего требуется радиометрический прибор в режиме реального времени, такой как детектор алмазного излучения, как описано Hutson (2018).

Этап 4. Все возможные измерения, связанные с работой роботизированной системы, должны быть записаны для последующего анализа деградации под воздействием радиации. Ховард и др. (2018) записали все входные и выходные сигналы каждого воспринимающего и управляющего компонента с высокой частотой дискретизации, равной 1.25 кГц, во время их тестового облучения с помощью рентгеновских лучей. Тем не менее, такие сигналы аппаратного уровня часто труднодоступны в промышленных роботах, но можно наблюдать, по крайней мере, ошибки управления от контроллеров роботов.

Набор эталонных данных, собранных во время движения по запланированной траектории, но до любого воздействия, желателен для анализа любого непосредственного воздействия излучения на работу робота.

Этап 5. Последним этапом оценки промышленного робота является запуск стационарной работы робота для определения общей устойчивости системы к излучению при сконфигурированной мощности дозы до тех пор, пока не произойдет отказ системы (как в Nagatani et al., 2011; Дюкрос и др., 2017). В результате на этапе оценки определяется экстремальная общая переносимость дозы промышленного робота и любые конкретные аппаратные/программные проблемы, ограничивающие всю систему.

Предлагаемая методология использовалась в текущем исследовании для оценки производительности системы манипулятора KUKA iiwa 7 LBR800, расположенного на расстоянии ~1,60 м от источника кобальта-60 мощностью 20 ТБк ( ⁶⁰ Co ).

3. Экспериментальная установка

3.1. Тестируемый робот

3.1.1. KUKA iiwa 7 LBR800 Робот

Роботизированный манипулятор KUKA iiwa 7 LBR800 производства KUKA Deutschland GmbH (2019 г.) был предложен для нескольких применений в атомной промышленности, включая обеззараживание перчаточных ящиков. Он имеет 7 шарниров вращения, обеспечивающих 7 степеней свободы, и имеет максимальную полезную нагрузку 7 кг при радиусе действия 926 мм. Робот обладает высокой гибкостью, что позволяет ему легко обходить препятствия. На рис. 1 показано расположение суставов робота. В каждом суставе робот имеет три различных типа датчиков, позволяющих измерять температуру, угловое положение и силу-крутящий момент.На каждом шарнире два энкодера используются для измерения углового положения, чтобы добиться хороших характеристик позиционирования рабочего органа на уровне миллиметра. Использование двух энкодеров обеспечивает некоторую избыточность, которую можно использовать для обнаружения отказа датчика, а сравнение их обратной связи используется для механизма безопасности управления роботом. Датчики силы и момента используются для обнаружения любых внешних сил, приложенных к роботу, что делает его «безопасным для человека» для работы, в которой люди сотрудничают с роботом.

Рисунок 1 . Робот KUKA iiwa 7 LBR800, используемый для испытаний на радиационную устойчивость. На левом изображении показан робот в его «нулевом» положении со всеми соединениями робота в исходных нулевых положениях. Указаны положительные направления каждого сустава. На правой фотографии показан робот во время макетных испытаний, в которых была запрограммирована периодическая траектория. Области красного цвета показывают места установки детектора излучения.

3.1.2. Идентификация компонентов с наименьшей радиационной устойчивостью

В каждом шарнире есть несколько электронных компонентов, таких как интегральные схемы моторных приводов, энкодеры и датчики крутящего момента, которые заключены в алюминиевый корпус.Эта совмещенная электроника представляет собой интересующие места, поэтому были проведены измерения мощности дозы, как показано на рисунке 1. Наиболее важным из них был «конечный эффектор», отвечающий за перенос инструментов, захватов и комплектов датчиков. Рабочий орган также, вероятно, получит более высокую дозу, чем другие компоненты, во время операций, связанных с радиоактивным материалом.

3.1.3. Испытательный источник облучения

Испытания на радиацию проводились в лаборатории Совета медицинских исследований (MRC) в Харуэлле.Как показано на рисунке 2, источник излучения состоял из четырех источников ⁶⁰ Co с общей активностью около 20 ТБк. Источники ⁶⁰ Co производят интенсивное гамма-излучение посредством распада до ⁶⁰ Ni , как показано на схеме распада на рисунке 3. Источник можно грубо рассматривать как точечный источник, расположенный в положении, отмеченном на рисунке 2B. .

Рис. 2. (A) Роботизированный манипулятор KUKA iiwa перед источниками кобальта-60 (B) .

Рисунок 3 . Бета-распад C2760o сопровождается гамма-излучением N2860i с энергиями 1,17 и 1,33 МэВ (Camp and Van Hise, 1976).

В процессе распада образовавшиеся бета-частицы поглощались корпусом трубки-источника, оставляя только гамма-кванты с энергиями 1,17 и 1,33 МэВ. ⁶⁰ Co используется в качестве удобного источника излучения, поскольку он присутствует в ядерных отходах и испускает фотоны, близкие по энергии к фотонам, испускаемым при распаде ¹³⁷ Cs , основной вклад в гамма-излучение живые ядерные отходы.Чтобы обнажить камеру, четыре источника ⁶⁰ Co были протолкнуты телефлексными кабелями через защитные трубы, проходя в камеру через свинцовый замок в четыре выступающие трубы для облучения. Источники могли быть изъяты в любой момент эксперимента.

3.2. Планирование траектории робота для динамического теста производительности

Робот-манипулятор был закреплен на месте, прикрепленном к тяжелому основанию, предназначенному для стабилизации робота в случае неожиданно высокого импульса в случае катастрофического отказа управления роботом.Робот был расположен так, чтобы все объекты были вне досягаемости, как показано на рисунке 2.

Плоскость x-z робота была выровнена с источниками, а трубки-источники были параллельны оси Y робота (см. исходные координаты робота на рис. 1). Исходное положение робота было примерно в 1,6 м от центра источников по его оси x.

Робот управляется для следования по заданной траектории, имитируя выполнение роботом повторяющейся задачи. Непрерывное движение манипулятора робота разработано таким образом, чтобы каждый из двигателей был активен в любое время.Следовательно, это оценивает, может ли каждый сустав оставаться физически способным двигаться во время воздействия (см. результаты в разделе 4). Рабочий орган робота считается наиболее важным компонентом системы, и его целевое воздействие составляет ~ 10 Гр / ч. В идеале рабочий орган робота должен управляться по дуговой траектории, сохраняя постоянное расстояние до предполагаемого точечного источника. Практически это невозможно, так как очень небольшие изменения расстояния от рабочего органа до источника приводят к заметным изменениям мощности дозы.Эти изменения легко преодолевались с помощью дозиметрии, работающей на частоте 20 Гц.

От центра точечного источника поток гамма-излучения затухает по мере увеличения расстояния от источника по закону обратных квадратов. Планировалось, что траектория рабочего органа робота будет следовать по дуге радиусом 1 м от предполагаемого точечного источника. Рабочий орган перемещался по дуговой траектории со скоростью 20 мм/с за период времени 1 мин, огибая источники излучения по повторяющейся схеме.Траектории были рассчитаны с помощью обратного кинематического алгоритма на основе матрицы Якоби, как описано Мередит и Мэддок (2004).

Манипулятор был подключен кабелем управления роботом (кабель X21-X31) к шкафу управления KUKA Sunrise, как показано на рис. 4. Блок управления располагался за пределами комнаты облучения (за бетонными стенами), что означало, что он получил небольшую дозу облучения. Хост-ПК был подключен через соединение RJ45 к блоку управления. По команде 1-минутного цикла хост-компьютер проинструктировал новые значения положения для каждого сустава в блоке управления, который передал их соответствующим суставам. В частности, была разработана управляющая программа на языке C++, обеспечивающая связь в режиме реального времени между стандартным хост-компьютером и Sunrise Cabinet. В программе управления использовался интерфейс прикладного программирования под названием KUKA Fast Robot Interface (KUKA Deutschland GmbH, 2019). Эта конструкция свела к минимуму задержку связи и, следовательно, обеспечила скорость управления/сбора данных 100 Гц.

Рисунок 4 . Настройка, обеспечивающая управление и запись данных робота LBR800.

3.3. Измерение мощности дозы в критических положениях

Основная цель испытаний заключалась в том, чтобы понять устойчивость к радиации, и для этого требовалось измерение дозы облучения робота. Требовалось измерение в режиме реального времени для точного количественного определения дозы, полученной до выхода из строя каждого интересующего компонента. Пассивное дозиметрическое измерение не подходило бы для этого испытания, поскольку нельзя было предсказать время до отказа, и отказ мог произойти, когда экспериментаторы не присутствовали, чтобы извлечь источники излучения и прекратить облучение.

Требуемые измерения особенно обременительны для детекторов излучения, поскольку воздействия было достаточно, чтобы повлиять на работу электроники. Наиболее подходящим доступным детектором был алмазный детектор излучения, откалиброванный для измерения мощности дозы кермы в воздухе, система, уже используемая в Селлафилде и описанная Hutson (2018). Этот детектор был выбран среди других полупроводниковых детекторов и сцинтилляционных детекторов за его превосходную радиационную устойчивость, и он уже был соответствующим образом откалиброван для целевой мощности экспозиционной дозы.В детекторе использовался монокристалл алмаза, выращенный методом химического осаждения из газовой фазы, размером 4,5 × 4,5 × 0,5 мм. Система алмазного детектора применяет калибровки мощности дозы, полученные с использованием как цезия-137, так и кобальта-60, и выдает значения мощности дозы кермы в воздухе каждые 50 мс. Детектор, работающий в текущем режиме, не имеет известного верхнего предела мощности дозы и доказал свою исключительную устойчивость к гамма-излучению.

Детектор по очереди размещали в нескольких местах вдоль манипулятора для количественной оценки экспозиции каждой связки электронных схем и датчиков, как показано на рис. 5.Для каждой позиции мощность дозы в реальном времени измерялась в течение 10 мин. После того, как экспозиция каждого сустава была измерена, алмазный детектор был присоединен к концевому эффектору робота на оставшуюся часть эксперимента для продолжения радиометрических измерений в реальном времени. Компонент концевого исполнительного элемента подвергся наибольшей дозе облучения и представлял наибольший интерес для испытаний, потому что в реальной операции по выводу из эксплуатации ядерной установки мог бы удерживать любой режущий инструмент или датчик.

Рисунок 5 .Мощность экспозиционной дозы варьировалась по длине манипулятора робота, поэтому алмазный детектор был установлен в разных местах на манипуляторе KUKA iiwa во время испытания на радиационную устойчивость, чтобы обеспечить возможность измерения мощности дозы, как показано на рис. 7.

3.4. Выявление снижения производительности робота

Было несколько индикаторов, помогающих определить снижение производительности и отказ манипулятора:

1. Требуемые и измеренные значения крутящего момента и положения в суставах записывались в режиме реального времени в электронную таблицу данных с частотой дискретизации 100 Гц.Перед облучением были зарегистрированы значения дуговой траектории робота для эталонного набора значений, которые можно было сравнить со значениями, записанными во время облучения. Любые различия в значениях до облучения и облучения будут свидетельствовать об ухудшении производительности робота.

2. Две веб-камеры записывали непрерывное видео в течение всего эксперимента по облучению. Примеры изображений приведены на рис. 6, показывая, что отснятый материал можно использовать для наблюдения за роботом в режиме реального времени и выявления любых неожиданных движений роботизированной руки.

3. Система KUKA отображала сообщения об ошибках манипулятора. Ожидалось, что программное обеспечение робота отключит систему из соображений безопасности в случае отказа компонента.

Рисунок 6 . Роботизированная рука наблюдалась во время динамического испытания на облучение с помощью двух веб-камер, расположенных внутри камеры облучения. Спекл можно наблюдать на обоих изображениях.

Таким образом, мы следовали описанной здесь методологии, состоящей из: (1) выявления уязвимых компонентов; (2) программирование повторяющейся траектории; (3) измерение мощности дозы облучения уязвимых компонентов; (4) измерение деградации; и (5) наблюдение за отказом системы.

4. Результаты и обсуждение

4.1. Измерение мощности экспозиционной дозы

Обязательно на разном расстоянии от источников излучения и при движении по дуге каждый набор датчиков и приводов подвергался воздействию разных потоков излучения. Поэтому для каждого интересующего места на роботе измерялся отдельный профиль мощности дозы, чтобы охарактеризовать условия облучения для каждого сустава. Эти профили мощности дозы, измеренные с помощью детектора алмазного излучения, показаны на рисунке 7.

Рисунок 7 . Усредненные измерения мощности дозы и углового положения каждого цикла динамической оценки (в течение 60 с) в течение 10 циклов. Угловое положение и мощности экспозиционной дозы показаны для каждого сустава: (А) в суставе 7; (B) на стыке 6; (C) на стыке 5; (D) на стыке 4; (E) на стыке 3; (F) в Стыке 2; и (G) в стыке 1.

4.2. Производительность робота до отказа

Во время первоначального динамического эксперимента робот должен был повторяться по запланированной траектории в течение ~6.3 ч. Это было преднамеренно повторяющееся действие, направленное на детальное понимание любых изменений параметров, происходящих в результате накопленного радиационного поражения. Эти хронические симптомы было важно понять, если они имеют какое-либо отношение к общему контролю над роботом.

• Отсутствие изменений траектории робота в результате воздействия было достаточно большим, чтобы его можно было заметить визуально с помощью изображений с веб-камеры.

• Никаких изменений траектории робота в результате облучения не было заметно по изменению профиля мощности дозы при сравнении дозиметрического профиля в начале и в конце динамической оценки.

• Небольшие изменения в стандартном отклонении ошибки управления соединением 2 начали происходить через 5 часов этого теста (в общей сложности после 8-часового воздействия) (показано красным цветом на рис. 8).

• Никакие другие соединения не претерпели такого увеличения ошибки управления во время облучения, что наводит нас на мысль, что это могло быть вызвано небольшим первоначальным дефектом в соединении 2, не обязательно вызванным исключительно радиационным повреждением.

Рисунок 8 . Оценка эффективности управления угловым положением робота в каждом суставе. (A) Среднеквадратичное значение (RMS) ошибки управления для каждого сустава. (B) Стандартное отклонение (S.D.) ошибки управления для каждого сустава.

4.3. Острая недостаточность

Робот вышел из строя во время стационарного воздействия по причине повреждения оптического энкодера в концевом эффекторе (шарнир 7). Этот компонент преобразует угловое положение шарнира в цифровой сигнал для обратной связи с контроллером. Поврежденный компонент был диагностирован самой системой управления KUKA с сообщением «ошибка энкодера датчика крутящего момента» и «безопасное положение оси недействительно», в результате чего контроллер предотвратил дальнейшую работу робота.Попытки перезагрузки, ремастеринга и восстановления движения робота по прошествии времени не увенчались успехом: этот неисправный компонент был безвозвратно уничтожен.

4.4. Мощность экспозиционной дозы и общая доза

Мощность дозы, измеренная дозиметрической системой с алмазным детектором, показана для каждого сустава в таблице 1 как для динамических, так и для стационарных оценок. Эти измерения были использованы для расчета общего воздействия на каждый сустав, как указано в таблице 2.

Таблица 1 .Мощность дозы воздействия кермы в воздухе на каждом суставе робота, измеренная с помощью системы мощности дозы алмаза.

Таблица 2 . Доза воздействия кермы в воздухе на каждое сочленение робота, измеренная с помощью системы мощности дозы алмаза.

Неопределенность измерения дозы составляет ±0,6 Гр при динамической оценке в течение примерно 9,3 ч. В рамках следующей статической оценки измерение дозы облучения имеет погрешность ±0,49 Гр за период около 7,5 часов. Доза облучения системы составляет приблизительно ±1.09 Гр неопределенность.

5. Обсуждение

Робот KUKA LBR800 перестал работать после большой дозы облучения 164,55 (±1,09) Гр на его концевой эффектор, а компонентом, вызвавшим отказ, был оптический энкодер. Неисправность этого компонента была отмечена управляющим ПО и контроллером smartPAD, что в последующем препятствовало работе робота. Встроенные функции интеллектуального программного обеспечения смогли отлично контролировать ситуацию, и мы смогли продемонстрировать, что после сбоя кодировщика программное обеспечение Kuka заблокировало робота в безопасном состоянии.Этот механизм отказоустойчивости в программном обеспечении был бы невозможен в других, более традиционных типах роботов, использующих меньшее количество электронных компонентов, поэтому такой подход к программному обеспечению следует рассматривать как существенное преимущество в плане безопасности для любого оператора ядерной установки, если такие сбои произойдут на объекте, имеющем ядерную лицензию. Наше испытание показывает, что стандартные функции безопасности помогают предотвратить аварию при обращении с ядерным материалом из-за медленного отказа системы.

На ядерной установке было бы полезно поддерживать показания кумулятивной дозы на соединениях (используя алмазные детекторы или другие миниатюрные детекторы аналогичного размера), чтобы гарантировать, что система может быть подвергнута профилактическому обслуживанию или замене компонентов, скажем, на 75% ее дозы. срок службы до отказа, а не ожидание отказа устройства на неудобной стадии процесса.

Целевая мощность дозы 10 Гр/ч была выбрана как консервативно высокая величина облучения для объектов САО, и в действительности она более точно соответствует мощности дозы, наблюдаемой на объектах, работающих с высокоактивными отходами. Мощность контактной дозы на объектах по обращению с САО, как правило, составляет 1 Гр/ч и ниже, поэтому для более точного моделирования объектов с САО было бы целесообразно использовать более низкие дозы облучения для будущих программ испытаний.

В этом документе представлена ​​методология тестирования готовых роботов в радиационной среде на системном уровне.Такие тесты на системном уровне имеют значительные преимущества, предоставляя справочные данные для развертывания робота в практических операциях, тем самым укрепляя уверенность в том, что система может использоваться в радиоактивных средах. Тесты на системном уровне также позволяют определить наименее устойчивый к радиации компонент. Ясно, что испытание на уровне системы является необходимой начальной оценкой для применения готовой системы в радиационной среде.

Обратите внимание, что инвестиции, необходимые для покупки полных готовых систем, таких как робот, протестированный в этой работе, значительны.Поэтому, несмотря на то, что важно проводить тесты на системном уровне для повышения уверенности в средах, существующих в реальных приложениях, стоимость уничтожения большого количества роботов будет непомерно высокой. Следовательно, для получения разумной уверенности в ожидаемом сроке службы рекомендуется следующая методология:

1. Испытание на системном уровне для проверки того, что готовый робот может удовлетворить первоначальные проектные требования в радиоактивной среде.

2. Идентификация отдельных компонентов, восприимчивых к излучению, путем покомпонентного анализа облученного робота.

3. Воздействие на статистически значимое количество идентифицированных восприимчивых компонентов, что позволяет оценить срок службы системы в зависимости от различных условий, таких как воздействие при нескольких мощностях дозы, различных температурах и других режимах нагрузки/работы робота. В сопоставимом исследовании были испытаны два образца каждого отдельного компонента для разработки радиационно стойкого робота для атомной промышленности (Sharp and Decreton, 1996). Находясь в хорошем компромиссе между статистической точностью и стоимостью, Oomichi et al.(2007) протестировали от 7 до 30 образцов различных компонентов. Для тестирования на уровне компонентов мы рекомендуем облучать и анализировать не менее 20 образцов, чтобы обеспечить строгий статистический анализ.

5.1. Рекомендации по дальнейшей работе

Из-за консервативного подхода к использованию новых технологий в атомной промышленности крайне важно, чтобы до их использования полностью понималась радиационная устойчивость новой технологии. В этом эксперименте аварийная доза гамма-излучения для манипулятора KUKA составила 164 Гр.Однако из-за вероятностного характера взаимодействия фотонов с веществом существует вероятность (которая основана на энергии фотонов и электронном материале), что когда фотон падает на электронное устройство в роботизированной руке, он не будет поглощен. Кроме того, процесс производства электронных компонентов приводит к распределению характеристик, поэтому, если эксперимент повторить, доза отказа может быть выше или ниже измеренной нами. Таким образом, дальнейшие испытания облучения обеих нескольких полных систем роботизированного манипулятора были бы полезны для подтверждения результата дозы отказа.Очевидно, что это будет иметь значительные финансовые последствия, поэтому мы рекомендуем вместо этого проводить испытания на облучение большого количества наименее устойчивых к радиации электронных компонентов (например, оптического энкодера). Это по-прежнему обеспечит точную цифру радиационной устойчивости всей системы.

Вторая рекомендация — починить/заменить сломанный энкодер в концевом эффекторе робота и попытаться восстановить полную функциональность робота. После того, как робот будет модернизирован, можно будет провести дополнительные испытания на облучение.Это было бы полезно для промышленности, поскольку продемонстрировало бы, что робота можно чинить и переустановить, а также предоставило бы больше данных об облучении руки.

Защита особенно уязвимых компонентов внутри робота может увеличить срок службы системы в радиоактивной среде. Было бы полезно испытать некоторые микроэкраны вокруг таких компонентов, как оптический энкодер в каждом соединении, ограниченные воздействием дополнительного веса от экранирования, что уменьшит возможную полезную нагрузку любых датчиков или исполнительных механизмов (например,г., захваты или резаки). Селективное экранирование может при ограниченных затратах существенно увеличить срок службы робота.

Следует рассмотреть возможность замены компонентов радиационно-устойчивыми альтернативами, если готовый робот оказался непригодным. Например, функцию, выполняемую оптическими энкодерами, могли бы выполнять поворотные энкодеры, которые, как известно, менее подвержены радиационному повреждению. Анализ затрат и выгод будет учитывать дополнительные затраты на внедрение новых компонентов и деньги, сэкономленные за счет увеличения срока службы робота.

Небольшие изменения в функциях безопасности программного обеспечения робота-манипулятора могут быть изменены, чтобы позволить роботу восстановиться в случае отказа сустава во время выполнения задачи. Робот с семью сочленениями имеет значительную кинематическую избыточность в положениях в пределах досягаемости, поэтому робот может выполнять свою задачу без работающего сочленения. Это еще больше продлит срок службы робота, в качестве альтернативы это может позволить роботу выполнять свои непосредственные задачи, а затем вернуться в безопасное состояние, готовое к ремонтному обслуживанию.

Будущие исследования могут моделировать/моделировать повреждения, нанесенные электронике робота, с использованием программного обеспечения для моделирования методом Монте-Карло, такого как пакет Geant4, разработанный CERN. Предыдущее исследование, подобное этому, было выполнено для применения радиационного повреждения электроники, используемой в космосе, Feng et al. (2007) и Xiao et al. (2018). Для такого моделирования потребуются более подробные сведения о распределении источников излучения, чем это обычно доступно для вывода из эксплуатации ядерных установок.

6. Выводы

В данной работе изучалось контролируемое воздействие гамма-излучения на робота KUKA iiwa LBR для определения его устойчивости и работоспособности в высокорадиоактивных средах, аналогичных объектам по переработке и хранению ядерных отходов.

Робот подвергся воздействию гамма-излучения от источника кобальта-60 мощностью 20 ТБк и продемонстрировал значительную радиационную устойчивость, при этом произошел отказ оптического кодировщика после совокупного облучения в 164,55 Гр за период 16.8 ч.

Результаты показывают, что силовые роботы, которые предлагают повышенный уровень точности для манипулирования объектами, потенциально жизнеспособны для приложений по переработке ядерных отходов. Используемые в соответствующих приложениях роботизированные технологии с использованием современного программного обеспечения для датчиков и управления могут оказать большое влияние на отрасль с точки зрения экономии средств, безопасности и сокращения сроков вывода из эксплуатации. В будущей работе следует рассмотреть альтернативные устойчивые к излучению замены оптических энкодеров, а также изучить методы микроэкранирования уязвимых компонентов для увеличения срока службы роботизированных систем.

Заявление о доступности данных

Все наборы данных, созданные для этого исследования, включены в статью/дополнительный материал.

Вклад авторов

TS, CH и KZ внесли свой вклад в концепцию и дизайн исследования. СН организовал облучение и измерил мощности дозы. JK и KZ запрограммировали управление, сбор данных робота-манипулятора, выполнили обработку данных и статистический анализ. CH, JK и KZ написали основные разделы рукописи.И KZ, и CH контролировали JK. TS и GH являются основными исследователями, связанными с этим проектом. Все авторы внесли свой вклад в доработку рукописи, прочитали и одобрили представленную версию.

Финансирование

Мы хотели бы поблагодарить UK Research and Innovation (UKRI) за их поддержку и финансирование, полученное через грант Национального центра ядерной робототехники (NCNR) EP/R02572X/1; из гранта Робототехники и искусственного интеллекта в ядерной области (RAIN) EP/R026084/1; и от Rad-Hard Diamond Detectors для гражданских ядерных приложений (грант ST/P001823).Финансирование также подтверждено Jacobs Engineering Group.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить компанию KUKA AG за поддержку, предоставившую программное обеспечение интерфейса приложения и предложившую потенциальные точки отказа. Мы хотели бы поблагодарить Боба Соколовски из Медицинского исследовательского совета, который поддержал экспериментальный доступ к радиационным установкам в Харвелле.Мы благодарим Эстель Талфан Дэвис за корректуру этой рукописи.

Ссылки

Айткен, Дж. М., Верес, С. М., Шаукат, А., Гао, Ю., Кукко, Э., Деннис, Л. А., и соавт. (2018). Автономное обращение с ядерными отходами. IEEE Intel. Сист. 33, 47–55. doi: 10.1109/MIS.2018.111144814

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Бришар Б., Боргерманс П., Фернандес А. Ф., Ламменс К. и Декретон А. (2001). Эффект излучения в кварцевом оптическом волокне, подвергнутом воздействию интенсивного поля смешанного нейтронно-гамма-излучения. IEEE Trans. Нукл. науч. 48, 2069–2073. дои: 10. 1109/23.983174

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Кэмп, Д., и Ван Хайз, Дж. (1976). Слабые гамма-лучи наблюдаются при распаде co 60 . Физ. Ред. C 14:261. doi: 10.1103/PhysRevC.14.261

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Ducros, C., Hauser, G., Mahjoubi, N., Girones, P., Boisset, L., Sorin, A., et al. (2017). RICA: Гусеничный робот для отбора проб и радиологической характеристики в ядерной области. Дж. Полевой робот. 34, 583–599. doi: 10.1002/роб.21650

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Фэн, Ю.-Дж., Хуа, Г.-Х., и Лю, С.-Ф. (2007). Радиационная стойкость для космической электроники. Дж. Астронавт. 28, 1071-1080

Академия Google

Ферле-Кавруа, В. (2011). «Электронное радиационное упрочнение — обеспечение радиационной стойкости и демонстрация технологий», в JUICE Instrument Workshop (Дармштадт).

Академия Google

Гарг, Р. , Джаякумар, Н., Хатри, С.П., и Чой, Г. (2006). «Подход к проектированию радиационностойкой цифровой электроники», в материалах Proceedings of the 43rd Annual Design Automation Conference (Сан-Франциско, Калифорния: ACM), 773–778.

Академия Google

Houssay, LP (2000). Робототехника и радиационное упрочнение в атомной отрасли (кандидатская диссертация). Государственный университет Флориды, Гейнсвилл, Флорида, США.

Академия Google

Ховард, Дж., Барт, Э., Шримпф Р., Рид Р., Адамс Л., Вибберт Д. и др. (2018). Методология выявления радиационных эффектов в роботизированных системах с вариациями механических и управляющих характеристик. IEEE Trans. Нукл. науч. 66, 184–189. doi: 10.1109/TNS.2018.2886242

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Хатсон, К. (2018). Алмазная дозиметрия для измерений в высокорадиоактивных ядерных средах (кандидатская диссертация). Бристольский университет, Бристоль, Великобритания.

Академия Google

Икбал, Дж., Тахир, А.М., ул Ислам, Р., и др. (2012). «Робототехника для атомных электростанций — проблемы и перспективы», в 2012 2-й Международной конференции по прикладной робототехнике для энергетики (CARPI) (Цюрих: IEEE), 151–156.

Академия Google

Кац Д.С. и Соме Р.Р. (2003). НАСА продвигает роботизированное исследование космоса. Компьютер 36, 52–61. doi: 10.1109/MC.2003.1160056

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

KUKA Deutschland GmbH (2019). LBR iiwa 7 r800, LBR iiwa 14 R820 Спецификация .

Академия Google

млн лет, Т.-П., и Дрессендорфер, П.В. (1989). Эффекты ионизирующего излучения в МОП-устройствах и схемах . Джон Уайли и сыновья.

Академия Google

Мередит, М., и Мэддок, С. (2004). Обратная кинематика в реальном времени: возвращение якобиана . Технический отчет, Технический отчет № CS-04-06, Департамент компьютерных наук, Шеффилдский университет.

Академия Google

Нагатани К., Кирибаяси С., Окада Ю., Отаке К., Йошида К., Тадокоро С. и др. (2011). «Испытание гамма-излучением электрических компонентов спасательного мобильного робота-айвы», в IEEE International Symposium on Safety, Security and Rescue Robotics , 2011 г. (Киото: IEEE), 56–60.

Академия Google

Управление по выводу из эксплуатации ядерных объектов (2019 г.). Очищение нашего ядерного прошлого: быстрее, безопаснее и быстрее .

Академия Google

Омичи, Т., Исодзаки Ю. и Кодзима М. (2007). Практическое проектирование роботов, работающих в радиационных средах. Доп. Робот. 21, 515–532. дои: 10.1163/156855307780108286

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Шарп Р. и Декретон М. (1996). Радиационная устойчивость компонентов и материалов в приложениях ядерных роботов. Надежный. англ. Сист. Саф. 53, 291–299. doi: 10.1016/S0951-8320(96)00054-3

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Цицимпелис, И. , Тейлор, С.Дж., Леннокс, Б., и Джойс, М.Дж. (2019). Обзор наземных роботизированных систем для характеристики ядерных сред. Прог. Нукл. Энергия 111, 109–124. doi: 10.1016/j.pnucene.2018.10.023

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Вюндрих, К. (1984). Обзор радиационной стойкости пластиковых и эластомерных материалов. Рад. физ. хим. 24, 503–510. дои: 10.1016/0146-5724(84)-7

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Сяо, Х., Хайдас В., Бовивр С., Краэнбюль Д., Зите Р. и Банерджи Н. (2018). «Моделирование радиационного повреждения в камере космического корабля для миссии ESA JUICE», в 2018 Международная конференция по радиационным эффектам электронных устройств (ICREED) (Хейлунцзян: IEEE), 1–4.

Академия Google

Недорогая электроника и программное обеспечение для фотонной статистики и корреляционной спектроскопии

Am J Phys. Авторская рукопись; доступно в PMC 2016 26 февраля.Гамари

Физический факультет Массачусетского университета, Амхерст, Массачусетс 01002

Dianwen Zhang

Физический факультет Массачусетского университета, Амхерст, Массачусетс 01002

Richard E. Buckman

Пекер Милас

Физический факультет Массачусетского университета, Амхерст, Массачусетс 01002

Джон С. Денкер

AT&T Laboratories Research (в отставке.), Florham Park NJ, 07932

Hui Chen

Wadsworth Center, Департамент здравоохранения штата Нью-Йорк, 120 New Scotland Ave, Albany, New York 12208

Hongmin Li

Wadsworth Center, Департамент здравоохранения штата Нью-Йорк, 120 New Scotland Ave, Albany, New York 12208 и Департамент биомедицинских наук, Школа общественного здравоохранения, Государственный университет Нью-Йорка в Albany, PO BOX 509, Albany, New York 12201-0509

Лори С. Голднер

Факультет физики Массачусетского университета, Амхерст, Массачусетс 01002

Бенджамин Д.Гамари, факультет физики Массачусетского университета, Амхерст, Массачусетс 01002;

^a Текущий адрес: Институт передовых наук и технологий Бекмана, Иллинойский университет в Урбана-Шампейн, 405 North Mathews, Urbana, Illinois 61801.

Abstract

Микроскопия и спектроскопия, чувствительные к отдельным молекулам, преобразуют лаборатории биофизики и материаловедения.Такие методы, как флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) и чувствительный к одной молекуле резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET), в настоящее время широко доступны в исследовательских лабораториях, но пока редко доступны в учебных лабораториях. Мы описываем недорогую электронику и программное обеспечение с открытым исходным кодом, которые устраняют этот пробел, делая современные исследовательские возможности доступными для студентов, интересующихся биофизикой. Мы включили обсуждение корреляционной функции интенсивности, относящейся к FCS, и того, как ее можно определить по времени прихода фотонов.Мы демонстрируем систему с измерением гидродинамического радиуса белка с использованием FCS, которая подходит для учебной лаборатории бакалавриата. Электроника на основе FPGA, которую легко сконструировать, также подходит для более сложных измерений, и здесь описано несколько приложений. В реализованном виде система имеет временное разрешение 8 нс, может управлять четырьмя лазерными источниками и может собирать информацию с четырех детекторов, считающих фотоны.

I. ВВЕДЕНИЕ

Благодаря таким методам, как флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) и динамическое светорассеяние (DLS), фотонная статистика уже более 40 лет открывает окно в свойства молекул и материалов.Общим для этих широко используемых методов является необходимость быстрого и эффективного сбора фотонов и расчета функций корреляции фотонов с временным разрешением менее 1 мкс. В последние годы обычным явлением стали фотодетекторы с высоким квантовым выходом и малым темным счетом, что снизило предел обнаружения до уровня, позволяющего регулярно наблюдать флуоресценцию отдельных молекул. В то же время наличие быстрой схемы синхронизации означает, что время прихода каждого обнаруженного фотона может быть определено с высоким разрешением. ^1,2 Подробная информация о потоке фотонов предоставила много новых возможностей для изучения статистики фотонов. ^1,2 Измерения флуоресценции, чувствительные к отдельным молекулам, которые в настоящее время революционизируют наше понимание молекулярной биофизики, особенно выиграли от лучшего оборудования. Высококачественные коммерческие инструменты ^1–3 и программное обеспечение ^1,4,5 для оценки статистики фотонов обычно используются в лабораториях биофизики, материаловедческих исследований и оптики.Однако стоимость этих систем, которая колеблется от нескольких тысяч до десятков тысяч долларов, не по карману почти всем учебным лабораториям и многим исследовательским лабораториям. Наша цель состоит в том, чтобы предоставить недорогую электронику и программное обеспечение с открытым исходным кодом, которые привносят в учебную лабораторию современные возможности измерения и анализа фотонной статистики, а также дают ценный урок приборостроения для бесстрашных студентов. Мы включили педагогическое обсуждение корреляционной функции интенсивности, относящейся к FCS, и ее вычисление непосредственно из времени прихода фотонов, которые составляют данные большинства современных инструментов.Эта работа также может оказаться полезной для аспирантов или других исследователей, заинтересованных в создании или лучшем понимании собственного аппаратного и программного обеспечения.

Все примеры и приложения, описанные здесь, включают обнаружение флуоресценции. Использование флуоресцентных красителей для изучения биологических или органических материалов очень распространено, и многие студенты могут иметь хотя бы некоторый опыт окрашивания. Окрашивание часто состоит из случайного введения красителей и полезно в основном для визуализации. В молекулярной биофизике принято модифицировать конкретную биомолекулу путем ковалентного присоединения флуорофора (молекулы красителя).В той мере, в какой фотофизические свойства флуорофора связаны с физическим движением (включая линейную и вращательную диффузию, складывание, скручивание и изгиб) или химической кинетикой (связыванием) биомолекулы-хозяина, краситель можно использовать в качестве наноскопического репортера эти молекулярные свойства. Фотоны, испускаемые флуорофором, несут информацию о биомолекуле, которая принимается детектором и оборудованием для измерения времени и декодируется с помощью статистического анализа.

В FCS флуктуации яркости красителя, которые связаны с молекулярной укладкой или связыванием, можно использовать для определения корреляции или времени релаксации для этих процессов. ⁶ Полезность метода вытекает из соотношения между коэффициентом диффузии D и размером молекулы, определяемым соотношением Стокса-Эйнштейна, ⁷

где k _B — постоянная Больцмана, T — абсолютная температура, η — динамическая вязкость среды, R _h — гидродинамический радиус диффундирующей частицы. В FCS флуоресцентные молекулы могут свободно диффундировать через объем обнаружения (≅ 1 фл) конфокального микроскопа.Время диффузии через объем определяется броуновским движением частицы, которое, в свою очередь, зависит от коэффициента диффузии. Если концентрация флуорофоров достаточно мала, то самые большие флуктуации интенсивности флуоресценции происходят просто потому, что среднее число молекул в объеме детектирования существенно колеблется по мере диффузии молекул внутрь и наружу. Типичное время диффузии молекулы для пересечения объема обнаружения в плоскости, перпендикулярной оптической оси микроскопа, определяется выражением τD=ω02/4D, где ω ₀ — радиус цилиндрически симметричный объем обнаружения.Это время диффузии отражено в корреляционной функции интенсивности флуоресценции как характерное время затухания, подробно рассмотренное в гл. III. Если ω ₀ известно, определение времени диффузии τ _D с использованием FCS дает D и, следовательно, также R _ч с использованием уравнения. (1); конкретный пример описан в гл. IV A. Мы отмечаем, что использование FCS для наблюдения за броуновской диффузией и измерения констант равновесия с помощью простого прибора было темой предыдущей статьи в этом журнале, ⁸ , в которой также были затронуты дополнительные темы, такие как моделирование и подбор данных корреляционной функции. .

Примерно десять лет назад корреляционные функции фотонов обычно генерировались аппаратными средствами, разработанными специально для этой цели. Этот процесс эффективен, но затратен с точки зрения информации, поскольку представление исходного потока фотонов не сохраняется. В качестве альтернативы запись интенсивности как функции времени может быть сохранена в виде количества фотонов, обнаруженных в последовательных интервалах времени; этот подход используется в работе. 8. Для фотонов, обнаруженных во временных бинах шириной менее 1 мкс, данные об интенсивности могут быть очень разреженными.В FCS нет ничего необычного в том, что средняя скорость счета фотонов составляет несколько кГц; даже при ширине бина 1 мкс подавляющее большинство бинов будет пустым. Лучшей альтернативой является запись времени прихода каждого фотона. Этот метод имеет явное преимущество, заключающееся в том, что он предоставляет наибольшую информацию о потоке фотонов в компактной форме. Корреляционная функция, заданная в FCS

G(τ)=〈Ia(t)Ib(t+τ)〉〈Ia(t)〉〈Ib(t)〉

(2)

можно рассчитать непосредственно по времени прибытия.Здесь I обозначает интенсивность флуоресценции, а индексы a и b могут обозначать данные, полученные в одном канале (т.е. a = b для автокорреляции) или в разных каналах детектора, соответствующих разным цветам. или поляризации (взаимная корреляция). Обсуждения о том, как вычислять корреляционные функции по временам прихода фотонов, существуют в литературе, ⁴ , но ни одно из них не доступно на уровне бакалавриата.

Примеры более продвинутых биофизических измерений с использованием этой системы обсуждаются в пп.IV B и IV C. При резонансном переносе энергии флуоресценции (FRET), описанном в гл. IV B к биомолекуле присоединяются два разных красителя, а не один краситель. Изменение расстояния между молекулами красителя регистрируется как изменение их относительной интенсивности флуоресценции, являющееся результатом резонансного диполь-дипольного взаимодействия. Комбинируя FRET с FCS, ⁹ , временной масштаб и характер флуктуаций молекулярной структуры, происходящих в нанометровом масштабе, можно определить с временным разрешением, ограниченным только электроникой.

Для обеспечения быстрого многоканального обнаружения и управления несколькими источниками возбуждения флуоресценции (например, лазерными линиями с разной длиной волны для возбуждения разных красителей) электроника основана на программируемой пользователем вентильной матрице (FPGA). Используя ПЛИС, электронику легко сконструировать, как обсуждалось в разд. II и в дополнительных материалах, а также дает возможность изучить инструменты, которые станут хорошим мостом для студентов, заинтересованных в экспериментальных исследованиях.Описанный прибор имеет восемь входных каналов, четыре выхода секвенсора для управления возбуждающим светом и временное разрешение 8 нс без мертвого времени между событиями. Использование ПЛИС обеспечивает гибкость конструкции; в частности, количество и конфигурация входных и выходных каналов легко модифицируются в соответствии с различными экспериментальными требованиями. Используемая здесь ПЛИС стоит менее 200 долларов. С необходимым генератором, разъемами и коммутационной коробкой общая стоимость составляет менее 400 долларов. Программное обеспечение и прошивка, необходимые для реализации и запуска устройства, включены в дополнительный материал. ¹⁰

Высококачественные системы (например, от Picoquant или Becker & Hickl), предназначенные для более требовательных приложений подсчета одиночных фотонов с временной корреляцией, имеют точность синхронизации, измеряемую в пикосекундах, и стоимость, измеряемую десятками тысяч долларов. Домашние системы на основе карт сбора данных, таких как National Instruments PCI 6602, могут быть построены примерно за 2000 долларов, но обеспечивают разрешение только в микросекундах. ¹¹ Плата с временным разрешением 42 нс и четырьмя входными каналами продается компанией ISS примерно за 15 000 долларов.Ни одна из этих систем не имеет выходных каналов для управления лазером.

II. ИНСТРУМЕНТЫ

A. Оптика

Минимальное оптическое оборудование, необходимое для FCS, состоит из конфокального микроскопа, лазера, фильтров и детектора. Ригер и др. ⁸ Дайте подробное описание, включая список деталей, для самодельного микроскопа FCS, подходящего для использования в учебных лабораториях, который включает в себя лазер и детектор примерно за 6000 долларов США. Комплект системы FCS с открытой рамой, подходящий как для учебных, так и для исследовательских целей, в настоящее время разрабатывается в сотрудничестве с Thorlabs.Стоимость этой установки, включая лазер DPSS и детектор, может составлять около 10 000 долларов.

Оптика, использованная в нашем эксперименте, схематично показана на рис. Возбуждающий свет подается в микроскоп через одномодовое оптическое волокно, которое также служит пространственным фильтром вместо точечного отверстия в Rieger et al. ⁸ Акустооптический настраиваемый фильтр (AOTF, номер детали NEOS 48058-5-.55) используется для переключения между линиями возбуждения, но не обязательно должен быть включен в обучающее устройство, использующее одну лазерную линию.Перед дихроичным зеркалом необходимо установить узкополосный одно- или двухполосный фильтр возбуждения, чтобы устранить утечку из нежелательных лазерных линий или накачки твердотельного лазера с диодной накачкой. Дихроичное зеркало отражает свет возбуждения и пропускает флуоресценцию с большей длиной волны. Телескоп после волоконного коллиматора служит двум целям. Во-первых, он увеличивает диаметр лазерного луча, чтобы он соответствовал размеру задней апертуры объектива. Это гарантирует, что вся числовая апертура (NA) объектива используется для фокусировки лазерного луча, тем самым минимизируя соответствующий фокусный объем.Телескоп также служит для отображения первого зеркала в задней фокальной плоскости объектива, что значительно упрощает юстировку микроскопа. В качестве объектива использовался Olympus UPlanSApo 60× с числовой апертурой 1,2. Для FCS необходима высокая числовая апертура по воде или нефти. Ограниченный дифракцией фокусный объем этих линз обычно составляет 1 фл, что приводит к такому же небольшому и четко определенному объему обнаружения, который удовлетворяет требованиям низкого фона для FCS или обнаружения с одним флуорофором.

Схема оптики.Объект: цель; AOTF: акустооптический перестраиваемый фильтр; FPGA: программируемая пользователем вентильная матрица; дет: детектор. Детекторы, считающие фотоны, генерируют импульсы уровня ТТЛ, время прихода которых регистрируется ПЛИС. FPGA также контролирует работу AOTF и регистрирует время изменения ее состояния.

Флуоресценция из фокального (обнаруживающего) объема микроскопа собирается обратно через объектив и визуализируется через точечное отверстие диаметром 50 мкм. Размер точечного отверстия зависит от выбора объектива, диаметра луча и фокусирующей линзы (тубусной линзы) и примерно выбирается в соответствии с размером фокального пятна. ¹² Тубусная линза под дихроиком должна быть хорошим ахроматом, чтобы избежать аберраций в пинхоле. Юстировка прибора с одним детектором подробно обсуждается в [1]. 8.

В описанных здесь экспериментах используются два детектора. В корреляционной спектроскопии флуоресценции (FCS) часто бывает удобно использовать неполяризующий светоделитель между двумя детекторами, чтобы прибор располагался в конфигурации Hanbury Brown and Twiss (HBT) ¹³ с двумя детекторами, измеряющими один и тот же сигнал. .В этой конфигурации взаимная корреляция нечувствительна к мертвому времени детектора и послеимпульсам. ¹⁴ Например, при одноканальном измерении невозможно наблюдать корреляции ниже мертвого времени детекторов, которое обычно составляет десятки наносекунд. Ниже 1 мкс в сигнале преобладают послеимпульсы детектора. В конфигурации HBT синхронизация фотонов между каналами ограничена только скоростью электроники, которая не имеет собственного мертвого времени. ²

Детекторы также можно настроить для поляризационных и/или двухцветных измерений, заменив неполяризующий светоделитель на поляризационный светоделитель или дихроичное зеркало.Детекторы, используемые в наших экспериментах, представляют собой высокоэффективные модули для подсчета фотонов с низким уровнем темнового счета, такие как фотоумножитель модели H7421-40 компании Hamamatsu или лавинный фотодиод, подсчитывающий одиночные фотоны τ-SPAD компании Picoquant. Менее дорогой альтернативой, подходящей для учебной лаборатории, является Hamamatsu h20682-110 стоимостью около 1300 долларов. Все эти устройства генерируют выходные импульсы уровня ТТЛ.

B. Электроника

Схема электроники, используемой в наших измерениях, показана на .Устройство построено на макетной плате KNJN Xylo EM FPGA. Эта плата включает в себя ПЛИС Altera Cyclone II (EP2C5), подключенную к главному компьютеру через USB-интерфейс Cypress FX2. Никаких дополнительных аппаратных средств или модификаций Xylo не требуется, хотя внешний кварцевый генератор на 32 МГц был установлен на чипе и умножен на 128 МГц для достижения временного разрешения 7,8 нс. Обзор работы электроники описан здесь. Подробную информацию о конструкции можно найти в дополнительных материалах. ¹⁰

Схема электроники. Устройство построено на макетной плате KNJN Xylo EM FPGA. Эта плата включает в себя ПЛИС Altera Cyclone II (EP2C5), подключенную к главному компьютеру через USB-интерфейс Cypress FX2. Tagger записывает время прихода фотонов от четырех детекторов на стробоскопических каналах и события секвенсора (Seq) на дельта-каналах. Секвенсор управляет переключением лазерной линии, если это необходимо, через AOTF.

Аппаратура записывает время прихода импульсов уровня ТТЛ от четырех устройств счета фотонов и обеспечивает четыре цифровых выходных линии для экспериментального контроля.Здесь выходы управляют акустооптическим перестраиваемым фильтром (AOTF), который используется для переключения между длинами волн возбуждения. Для однолинейного возбуждения, обычно используемого в учебной лаборатории, выходные линии не используются.

Прошивка ПЛИС ¹⁵ основана на конструкции детектора множественных совпадений с метками времени, разработанной Поляковым и др. ¹⁶ Код был адаптирован и расширен для включения дополнительных входных каналов и цифровых выходов для экспериментального управления и синхронизации.Прошивка разделена на два логических блока: таймер и секвенсор.

Теггер времени (Tagger in ) отвечает за запись времени поступления событий на набор входов. Входы обозначены как «дельта» и «строб» и требуют сигналов уровня TTL. Дельта-входы фиксируют изменения цифровых выходных каналов (события секвенсора), а стробирующие входы записывают сигналы синхронизации фотонов. Типы данных Strobe и Delta записываются Tagger с использованием формата, показанного на рис. Первые 36 бит содержат время события в тактах, а старшие биты содержат вспомогательную информацию о событии.Для стробирующих событий биты 37–40 указывают исходный канал (или каналы) события. Для дельта-событий биты 37–40 записывают состояние секвенсора сразу после изменения. Бит 46 указывает тип события (строб или дельта). Биты 47 и 48 указывают на переполнение счетчика и события сброшенной записи соответственно.

Формат записи данных. Первые 36 бит содержат время события в тактах. Старшие биты записи содержат вспомогательную информацию о событии. Биты 37–40 указывают исходный канал (или каналы) события, а бит 46 указывает тип события (строб или дельта).Биты 47 и 48 указывают на переполнение счетчика и события сброшенной записи соответственно.

Модуль секвенсора предназначен для управления лазерными источниками возбуждения. Каждый канал секвенсора может быть запрограммирован на создание периодического сигнала TTL. Выходы секвенсора можно использовать, например, для управления цифровыми входными каналами AOTF, тем самым контролируя длину волны возбуждающего света. Изменения выходных сигналов секвенсора и, следовательно, длины волны (длин волн) возбуждения записываются на входах дельта-канала тегера событий, как описано выше.Таким образом, переходы выходного состояния секвенсора фиксируются вместе с фотонными событиями, записанными с использованием стробирующих каналов. Это облегчает реализацию переменного лазерного возбуждения, как описано в гл. IV C. С различными электрооптическими элементами стробоскопические каналы также можно использовать для переключения поляризации или фотоактивации.

Пакеты программного и микропрограммного обеспечения для программирования и запуска электроники на платформе Linux, а также инструкции по установке включены в Дополнительный материал. ¹⁰ Эти материалы включают необходимые прошивки (в пакетах « timetag-fpga » и « timetag-fx2 »), пользовательский интерфейс для экспериментального контроля («timetag-tools»), а также средства обработки и анализа данных написан на Python и C++ («фотонные инструменты»).

III. РАСЧЕТ КОРРЕЛЯЦИОННОЙ ФУНКЦИИ ДЛЯ FCS

A. Концептуальный обзор

Корреляционная функция, используемая в FCS, определяется формулой. (2). Интенсивность I ( t ) обычно не является непрерывной функцией времени, а состоит из дискретных событий прибытия фотонов.Средние скорости счета фотонов в FCS обычно находятся в диапазоне от 1 до 100 кГц. Однако временная шкала, представляющая интерес для большинства измерений, часто значительно ниже 1 мс, а данные собираются с точностью синхронизации от 1 пс до 1 мкс. Разреженность данных об интенсивности делает неэффективными традиционные численные схемы хранения данных и выполнения расчетов. Рассмотрим, например, сбор отсчетов фотонов за время 90 453 T 90 454 во временных бинах шириной Δ 90 453 t 90 454 . Для разреженных данных необходимое количество бинов (90 453 T 90 454 /Δ 90 453 t 90 454) намного превышает общее количество полученных фотонов, которое обычно составляет порядка 10 ⁶ –10 ⁸ .В этом случае эффективнее и информативнее регистрировать моменты прихода фотонов напрямую.