Работа с пдз: Работа с просроченной дебиторской задолженностью

Содержание

Работа с дебиторской задолженностью | Аккаунтор

В условиях пандемии COVID-19 и связанной с ней сложной экономической ситуацией, многие компании всё чаще сталкиваются с тем, что их партнёры не выполняют взятых на себя обязательств. В 2021 году после снятия ограничений для многих наших клиентов стали актуальными вопросы, связанные с дебиторской задолженностью.

Основные фазы

Дебиторская задолженность – право требования к контрагенту, который не выполнил обязательства по оплате товаров, либо не выполнил работы или не оказал услуги. Если контрагент-должник не выполнил свое обязательство в установленный в договоре срок, то такая задолженность становится просроченной, и компания-кредитор получит право предпринимать действия по её взысканию.

В качестве превентивных мер можно:

При возникновении проблем с контрагентами лучше всего сначала попробовать договориться о погашении, либо реструктуризации задолженности на приемлемых для обеих сторон условиях. Если договориться по-хорошему по каким-то причинам невозможно, то остаются только варианты попытаться взыскать задолженность в судебном порядке, либо продать коллекторам (как правило, с дисконтом).

Для начала процедуры взыскания как минимум необходимо постоянно контролировать сроки оплаты по договорам и своевременно выявлять, по каким из них требуется предпринимать действия по пересмотру, либо взысканию. Просроченная дебиторская задолженность, по которой кредитор не предпринимает действия по взысканию, может стать безнадежной в двух случаях:

  • После истечения срока исковой давности;
  • На основании акта государственного органа о невозможности взыскания, либо ликвидации или банкротства компании-должника.

В этом случае кредитор вынужден будет списать такую безнадежную задолженность в убыток, что негативно отразится на его балансе. Определение сомнительного и безнадёжного долга и порядок формирования резервов по ним регламентированы статьёй 266 НК РФ.

Налоговые риски

Необходимо внимательно подходить к выбору контрагента. Например, подробные разъяснения о порядке применения статьи 54.1 НК РФ, в том числе о том, как ФНС будет проверять обоснованность выбора контрагентов и оценивать осмотрительность,даны в недавнем письме ФНС от 10. 03.2021 БВ-4-7/[email protected]

В случае, если контрагент окажется ненадежным, то у компании-кредитора помимо безнадежной дебиторской задолженности могут возникнуть сложности с возмещением НДС.Письмо Министерства финансов РФ от 26 октября 2017 г. № 03-07-11/70423:

В связи с письмом по вопросу о возмещении из бюджета сумм налога на добавленную стоимость, уплаченных в бюджет при оказании услуг, обязательство по оплате которых покупателем не исполнено и признано безнадежным, Департамент налоговой и таможенной политики сообщает, что возмещение налога на добавленную стоимость в данном случае нормами НК РФ не предусмотрено

.”

Из письма Министерства финансов РФот 13 марта 2015 г. N 03-07-05/13622:

в случае списания банком дебиторской задолженности по оплате оказанных услуг, облагаемых налогом на добавленную стоимость, исчисление налога для уплаты в бюджет следует производить в том налоговом периоде, в котором списана данная задолженность. Такие суммы налога на добавленную стоимость уплачиваются за счет собственных средств в порядке, установленном статьей 174 Кодекса

Принцип должной осмотрительности

Налоговые органы Российской Федерации придерживаются позиции, что при заключении любой сделки любая компания должна исходить из принципа должной осмотрительности, т. е. проявить максимальную бдительность и проводить анализ контрагента, с которым заключается контракт. В противном случае компания-кредитор может быть привлечена к налоговой ответственности, в отношении руководителя компании-кредитора может быть возбуждено уголовное дело и его могут привлечь к уголовной ответственности (например, по статье 159 УК РФ Мошенничество или статье 199 УК РФ – Уклонение от уплаты налогов, сборов, подлежащих уплате организацией, и (или) страховых взносов, подлежащих уплате организацией – плательщиком страховых взносов). Кроме того, согласно упомянутому письму ФНС от 10.03.2021 БВ-4-7/[email protected], в случае, если налоговыми органами будет доказано то, что компания знала о недобросовестности контрагента (

в том числе при выборе контрагентом поставщиков, соисполнителей и субподрядчиков), то компании может быть отказано в вычете по НДС. Из письма:

негативные последствия неисполнения контрагентом, ведущим экономическую деятельность, обязанности по уплате налога на добавленную стоимость в должном размере могут быть возложены на налогоплательщика в виде отказа ему в праве на применение вычетов сумм данного налога при условии, если налоговым органом будет доказано, что налогоплательщик знал о налоговых правонарушениях, допущенных контрагентом (в том числе в результате невыполнения контрагентом требований подпункта 2 пункта 2 статьи 54.

1 Кодекса в отношении привлекаемых им поставщиков (субподрядчиков, соисполнителей), и извлекал выгоду из противоправного поведения контрагента за счёт причинения ущерба бюджету Российской Федерации. Данный подход основывается на правовой позиции, выраженной в определении Судебной коллегии по экономическим спорам Верховного Суда Российской Федерации от 25.01.2021 № 309-ЭС20-17277.

    Оптимизация дебиторской задолженности у ресурсоснабжающих организаций

    В условиях кризиса у ресурсоснабжающих организаций возникают трудности со сбором оплаты за предоставленные услуги. У большинства абонентов теплосетей и водоканалов падает выручка. Кроме того, Правительство РФ приостановило взыскание неустойки за несвоевременную или неполную оплату услуг ЖКХ.

    Чтобы оптимизировать дебиторскую задолженность, предприятиям нужны эффективные инструменты для контроля взаиморасчетов и управления взысканием просроченных платежей.

    Во многих теплосетях и водоканалах работа с дебиторской задолженностью не автоматизирована или автоматизирована слабо. Это снижает эффективность работы специалистов, занимающихся сбором платежей — менеджеров по сбыту и юристов.

    В итоге:

    • возникновение просроченной дебиторской задолженности не всегда отслеживается вовремя. Это значительно повышает риск пропустить момент, когда абонент не просто перестал платить, а уже обанкротился, и задолженность стала безнадежной;
    • большое количество дебиторов при отсутствии автоматизации приводит к тому, что специалисты просто не успевают обработать все просрочки — обзвонить должников, отправить им претензии, организовать судебные разбирательства со злостными неплательщиками;
    • выявление абонентов, которых можно отключить, и подготовка документов на отключение — трудоемкие задачи. Если все операции по отключениям выполнять вручную — своевременно это сделать не удается, в результате задолженность еще больше увеличивается;
    • из-за отсутствия актуальной информации о состоянии текущего долга от услуг могут несправедливо быть отключены абоненты, которые уже погасили свою задолженность.

    Чтобы предотвратить неконтролируемый рост дебиторской задолженности, все мероприятия по предотвращению, контролю, претензионной и исковой работе должны быть систематизированы, регламентированы и автоматизированы.

    Необходимо:

    • полностью исключить человеческий фактор из процессов работы с дебитором. Разработать регламенты по взысканию задолженности. Описать и автоматизировать бизнес-процессы на основе этих регламентов;
    • заложить ответственность за чёткое следование регламентам в систему мотивации сотрудника организации;
    • выполнять постоянный мониторинг исполнительской дисциплины;
    • анализировать эффективность работы с дебиторской задолженностью и выявлять возможности для ее дальнейшей оптимизации.

    Перечень действий одного исполнителя в течение дня может включать множество разных задач:

    • позвонить;
    • написать;
    • отправить претензию по почте;
    • проконтролировать факт получения претензии;
    • подготовить пакет документов;
    • поручить мастерам провести отключения по утвержденному приказу и т.  д.

    Автоматизированная система управления дебиторской задолженностью позволяет организовать эффективное выполнение этих задач: в правильной последовательности и в  установленные сроки.

    Решения «1С:Управление теплосетью 2», «1С:Управление водоканалом 2» и «1С:Управление тепловодоканалом 2», разработанные совместно фирмой «1С» и компанией ООО «Софт-портал проект», автоматизируют множество задач ресурсоснабжающих предприятий — от формирования структуры сети тепловодоснабжения, до выставления счетов абонентам, учета оплат и ведения претензионно-исковой работы.  Функционал программ позволяет работать как с должниками-физлицами, так и с юридическими лицами.

    Система ставит сотруднику задачи и по результатам их выполнения помогает выбрать  дальнейшие действия:

    Кроме того, системе можно поручить отслеживание сроков работ по регламенту, рассылку электронных писем, автоматический обзвон должников и сбор документов для выставления претензии. Процессы контроля и взыскания дебиторской задолженности можно настроить в соответствие с потребностями каждой конкретной организации.

    В результате предприятие получит систему, которая позволит:

    • выявить дебиторов, задолженность которых просрочена и требует принятия мер по взысканию;
    • сформировать программу действий по взысканию задолженности и выдать задания исполнителям;
    • проконтролировать выполнение задач на каждом этапе взыскания задолженности;
    • получить подробный отчет о том, на какой стадии находится работа с каждым конкретным должником;
    • оценить состояние дебиторской задолженности по предприятию в целом;
    • проанализировать эффективность различных методов взыскания задолженности.

    В любой момент времени в программе можно сформировать отчет о состоянии работы с каждым дебитором:

    При открытии программы на начальную страницу выводятся уведомления о текущих и просроченных задачах. Это позволяет контролировать исполнительскую дисциплину сотрудников и повышать качество работы с дебиторской задолженностью.

    Программы имеют наборы предварительно настроенных маршрутов бизнес-процессов общего вида по исковой, претензионной и неформализованной работе. Эти маршруты можно перестроить под нужды конкретного предприятия, опираясь на конкретные регламенты и правила.

    Регламентам и автоматизации — быть

    Если в компании регламентов для управления дебиторкой еще нет — самое время их создать и автоматизировать. И это не так сложно, как может показаться. Для начала достаточно просто описать то, что происходит уже сейчас, и добавить получившемуся регламенту задачу по ежемесячному анализу результатов работы и улучшению процессов. Затем, по мере возникновения новых неучтённых обстоятельств, —  развивать карты маршрутов выполнения задач.

    При таком подходе, со временем, бизнес-процессы управления задолженностями эволюционируют в совершенную машину по контролю уровня дебиторской задолженности и предупреждению ее разрастания. Если все сделать правильно, за дебиторской задолженностью будет следить программа, пользователю останется лишь своевременно выполнять выдаваемые ею задачи, и анализировать результаты выполнения этих задач.

    Дебиторская задолженность тренинг управление дз и пдз

    Дебиторская задолженность тренинг по управлению дз и пдз в дистрибьюторе и производителе Food, non Food поможет вашим торговым представителям повысить дисциплину оплат и минимизировать просроченную дебиторскую задолженность клиентов. Ваша торговая команда получит эффективный пошаговый алгоритм управления дебиторской задолженностью, а так же готовые скрипты телефонных звонков вашим должникам, шаблоны e-mail писем и смс напоминалок, универсальные готовые фразы ответы на наиболее частые отговорки недобросовестных клиентов и многое другое.

    Управление дебиторской задолженностью: краткая программа тренинга.

    1. Способы повышения дисциплины платежей у клиентов
    2. Классификация клиентов: добросовестные и нет
    3. Важные моменты при оценке платежеспособности клиента (профилактические меры)
    4. Сегментация клиентов: правило Парето 80/20
    5. Управление рисками: возврат долга / потеря клиента
    6. Агрессивный и либеральный подходы в работе с должниками
    7. Основные методы воздействия на клиентов, допустивших просроченную дебиторскую задолженность
    8. Этапы планирования работы с должниками
    9. Основные принципы для управления дебиторской задолженностью
    10. Пошаговый алгоритм работы с должниками и пдз
    11. E-mail письма – готовые шаблоны писем
    12. Телефонный звонок должнику – готовый сценарий разговора
    13. Личная встреча – сценарий переговоров о возврате пдз

    Требовать гарантийное письмо об оплате или уже пора вручать претензионное письмо и идти в суд? все это мы подробно разберем на тренинге по управлению дебиторской задолженностью в дистрибьюторе и производителе.

     

    Каждый день Вы видите работу ваших менеджеров, и знаете, где они хороши, а где недожимают.

    И улучшив у них этот конкретный навык, Вы получите больше продаж.

    На этой странице именно этот навык, который необходимо улучишь в первую очередь?

    Что Вы получаете при покупке тренинга управление дебиторской задолженностью:

    Модульный живой тренинг, который посвящен отработке только одного конкретного навыка у ваших торговых представителей управление дебиторской задолженностью.

    Менеджеры по работе с клиентами, торговые представители получают на тренинге навык профессионального управления дебиторской задолженностью

    После тренинга ваши торговые будут вести переговоры по возврату долгов профессионально, научатся управлять дебиторской задолженностью так, чтобы сумма ПДЗ (просроченной дебиторской задолженности) была минимальна и стремилась к нулю.

    Тренинг проходит в вашем офисе, в удобное Вам время, длительность тренинга 6 часов.

    Курс, семинар, тренинг «Управление просроченной дебиторской задолженностью»

    Какие инструменты ваша Компания применяет , чтобы возвращать дебиторскую задолженность ваших клиентов или партнеров? Что можно предпринять компаниям для профилактики просроченной дебиторской задолженности, исходя из успешного российского опыта? Какой сценарий управления просроченной дебиторской задолженностью может применять менеджер по продажа или бухгалтер или специалист по ПДЗ и получить результат? Как успешно противостоять давлению, избеганию и агрессии клиентов-должников? Как улучшить управление и контроль за дебиторской задолженностью в вашей Компании? Как влиять на все виды клиентов- должников? Все это узнают и отработают участники тренинга «Управление просроченной дебиторской задолженностью».

    • ПДЗ: корректное представление о торваном\финансовом кредите.
    • Основные причины просроченной дебиторской задолженности и невозврата долгов.
    • Индикаторы ПДЗ в поведении разных типах должников.
    • Ключевые компетенции для корректной коммуникации с клиентами-должниками.
    • Успешный «скрипт» и сценарий разговора.
    • Эго-состояния в деловой коммуникации. Правила удержания эффективного эго-состояния.
    • 6-ступенчатый алгоритм в коммуникации по взысканию ПДЗ.
    • Телефонные «лайфхаки».
    • Ключевые правила жестких переговоров. 5 ключевых переговорных стратегий.

    Для кого: для широкой аудитории сотрудников, руководителей, специалистов, для которых в процессе профессиональной деятельности значимо обладать высокой компетентностью в области деловой коммуникации, бизнес-коммуникацией, как с конечными клиентами, так и с внутренними клиентами других подразделений; для специалистами формата «фриланс», для которых важно эффективное установление и поддержание деловых контактов и презентация своих идей\решений\продуктов.

    Какие проблемы решает тренинг:

    • Сложные ситуации в деловых коммуникациях по взысканию просроченной задолженности
    • Отсутствие результата \ слабые результата взыскания ПДЗ
    • Необходимость в эффективных, результативных письмах и вербальных деловых коммуникациях по взысканию по взысканию просроченной задолженности
    • Слабое владение инструментами влияния, власти, убеждения в деловой коммуникации
    • Слабое владение управлением результатами с помощью бизнес-коммуникаций с разными типами клиентов-должников
    • Стресс, неудачи, негатив, слабые результаты от коммуникации с клиентами-должниками
    • Отсутствие системы в управлении просроченной дебиторской задолженностью

    В результате тренинга вы:

    • Пресекать возможные риски возникновения дебиторской задолженности и партнеров-должников
    • освоите техники деловой вербальной и письменной коммуникации для взыскания просроченной задолженности и долгов
    • Усвоите техники и правила взыскания долгов, без нарушения правил делового этикета и законности
    • овладеете техниками аргументированного, властного, влияющего, внушающего общения,
    • получите объективную оценку личного уровня технологии ведения жестких переговоров и уверенности («ассертивности»)
    • научитесь управлять эмоциональным накалом в общении
    • получите информацию о разных типах должников и проверенных способов результативного влияния на разные типы должников на разных этапах возникновения дебиторской задолженоости
    • усилите ваше влияние на клиентов-должников и повысите собираемость долгов
    • разовьете навыки уверенности и уверенной коммуникации
    • научитесь распознавать манипуляции и преодолевать их
    • получите проверенную успешную систему профилактики и взысканию просроченной дебиторской задолженности на ранних и длительных сроках задолженности

    Цели тренинга:

    • Научить сотрудников эффективно и системно работать с должниками и добиваться конкретных результатов
    • Изучить основы результативной вербальной\невербальной коммуникации по взысканию просроченной задолженности
    • Получить знания по основным принципам написания эффективных деловых писем по взысканию просроченной задолженности
    • Развить умение быть конструктивным, деловым, уверенным в различных ситуациях бизнес-коммуникации.
    • Развить умения управления своим эмоциональным состоянием в ходе сложных ситуаций
    • Освоить техники ассертивной (уверенной) коммуникации и бесконфликтного общения
    • Доработать или сформировать управляемый бизнес-процесс управления просроченной дебиторской задолженностью

    Все обучающие модули могут рассматриваться в контексте тем тренингов, проводимых участниками в рабочей деятельности.

    Методы тренинга: презентация, интерактивная мини-лекция, кейс-метод, групповая дискуссия, работа в малых группах, ролевая игра, отработка инструмента, деловая игра, разминка-энерджайзер

    Содержание тренинга:

    Просроченная дебиторская задолженность

    • ПДЗ: корректное представление о торваном\финансовом кредите.
    • Основные причины просроченной дебиторской задолженности и невозврата долгов.
    • Индикаторы ПДЗ в поведении разных типах должников.
    • Привычные отговорки должника.
    • Для чего ПДЗ существует для компании\для клиентов.
    • Правила торговли: кто сказал, что клиент всегда прав?
    • Основные недочеты в работе с ПДЗ.
    • Практическая часть: тестирование уровня комплексной работы с ПДЗ в Компании участников тренинга.
    • Пошаговый подход профилактики дебиторской задолженности: 8 правил.

    Телефонное взаимодействие с клиентами-должниками. Эффективное поведение специалиста по взысканию ПДЗ

    • Ключевые компетенции для корректной коммуникации с клиентами-должниками.
    • Правила подготовки к контакту с должниками. «Физики», «юрики».
    • Практическая часть: подготовка к коммуникации о взыскании ПДЗ.
    • План начала коммуникации с клиентами-должниками.
    • Правильная постановка целей.
    • Практическая часть: правильная постановка SMART-целей.
    • Успешный «скрипт» и сценарий разговора.
    • Уверенная позиция в коммуникации с клиентами-должниками.
    • Практическая часть: тестирование уровня уверенности в коммуникации.
    • Эго-состояния в деловой коммуникации. Правила удержания эффективного эго-состояния.
    • Практическая часть: удержанию успешного эго-состояния в коммуникации.
    • Инструменты уверенного поведения («корректный отказ», «частичное согласие», «размытие», «наведение тумана» и проч.).
    • Практическая часть: инструменты уверенного поведения.
    • Способ подстройки с помощью нужной роли.
    • Практическая часть: ролевое моделирование коммуникации с должниками («физики», «юрики»).

    Правила результативной коммуникации. Психологические аспекты взыскания долгов

    • 6-ступенчатый алгоритм в коммуникации по взысканию ПДЗ.
    • Телефонные «лайфхаки».
    • Развитие влияющей позиции в общении с клиентами-должниками.
    • Эффективный имидж менеджера по ПДЗ.
    • Что «продает» менеджер по ПДЗ – клиентам-должникам?
    • Вербальные и невербальные средства для воздействия на клиентов-должников.
    • Практическая часть: результативная коммуникация с клиентами-должниками.
    • Техники аргументации и контраргументации. Метод критериев, метод значимости, метод изоляции проблемы и т.п.
    • Вербальные ловушки.
    • Практическая часть: успешные и не срабатывающими фразы.
    • Типология клиентов-должников участником тренинга.
    • Где «кнопки» у клиентов-должников?
    • Результативное воздействие на разные типы клиентов-должников.
    • Практическая часть: успешная коммуникация с клиентами-должниками.

    Основные принципы работы с ПДЗ

    • Неэффективные сообщения. Частые ошибки деловой переписки.
    • Основные принципы работы с краткосрочной ПДЗ.
    • Основные принципы работы с длительной ПДЗ.
    • Способы воздействия на должников (смс-оповещение, открытые списки и проч). Черные списки должников.
    • Ключевые правила жестких переговоров. 5 ключевых переговорных стратегий.
    • Практическая часть: тестирование переговорных стилей участников тренинга.
    • Коммуникационные барьеры, искажающие информацию.
    • Коммуникативные техники, уменьшающие потери информации.
    • Психологическое давление со стороны клиентов-должников (манипуляции, агрессия, избегание и проч.).
    • Защитная позиция клиентов (мольбы, вымогательство сочувствия, «вечный бой» и проч.).
    • Типология манипуляций. Индикаторы манипуляций.
    • 2 основные тактики преодоления манипуляций.
    • Активная аргументация. Помощь «добросовестным» должникам.
    • Практическая часть: тактики преодоления манипуляций.
    • Решение кейсов (ситуаций) участников тренинга.

    Эмоциональный аспект коммуникации

    • Профессиональные рабочие установки.
    • Стресс в трудных ситуациях взаимодействия с клиентами. Основные причины стресса. Эустресс и дистресс.
    • Способы определения стрессового состояния и преодоления стресса.
    • Техники, предупреждающие эмоциональное «выгорание».
    • Отработка техник эмоционального баланса.

    Ответы тренера на вопросы группы. Подготовка стратегии профессионального развития участников тренинга на основе полученной обратной связи от тренера в течение всего тренинга.

    По вашему желанию в ваш тренинг войдет:

    • Расширенный раздаточный материал.
    • Список литературы.
    • Книги по теме в цифровом формате.
    • Оценка уровня вашего владения инструментами по теме тренинга: управление просроченной дебиторской задолженностью.
    • Пост-тренинг в виде индивидуальной коучинг-сессии в течение месяца после тренинга (по договоренности).

    Алексей Кузнецов

    Бизнес-тренер, коуч, практический психолг

    Специализация: логистические услуги, производство, добыча\горное дело, retail, услуги (В2С, В2В), продажи (Интернет-магазины, розница, В2С, В2В), продажа услуг, НоRеСа, сфера развлечений, pharma, продажи спиртного, кормовые добавки, продажа недвижимости, логистика, обучение(высшее образование, тренинги), саморазвитие и др.

    Выполнял работы для компаний: Банк УБРИР, Иркут, YKK, Rolf, Инград, Lukiol, Компания «АЗБУКА», Интернет-магазин «Техпорт», Банк Убрир, «Иркут», «Рольф», «Ренессанс Кредит», Компания «АЗБУКА», Интернет-магазин «ТехПорт» (techport.ru), «Select Service Partners Russia», «Melange Group», «ПромЭкспертиза», «Shlumberger», «МТС», «X5 Retail Goup», ОАО «Медицина», «Ely Lilly», Корпорация «Техно-НИКОЛЬ», ОАО «Апатит ФосАгро», СПСР-Express, Jumbo Toys, Michelin, Фабрика инновационной мебели, Аэропорт Домодедово Eastline, Sharp, Pioneer, Краски Tikkurila, AST International Environment, Университет Витте, Российское автомобильное товарищество, Geekwarz, International Coach Federation, Saria, Deloitte & Touche CIS и другие.

    Специализация: логистические услуги, производство, добыча\горное дело, retail, услуги (В2С, В2В), продажи (Интернет-магазины, розница, В2С, В2В), п…

    Резюме преподавателя

    Даты начала обучения не определены.

    7 советов, как бороться с дебиторской задолженностью.

    Журнал Землеройная техника

    Разработайте корпоративный стандарт по работе с дебиторской задолженностью

    Чтобы минимизировать риски, необходимо разработать (и выполнять) систему работы с дебиторской задолженностью, где будут четко прописаны сроки и порядок действий, а также ответственные лица. Если с каждой просроченной задолженностью работать как с уникальной ситуацией, вы будете действовать неэффективно.

    В качестве утвержденного на корпоративном уровне может быть следующий порядок действий: претензия, повторная претензия, остановка отгрузок и работ на объекте, вывоз оборудования, обращение в суд. Но, как показывает практика, только в небольшом количестве компаний существуют подобные внутренние стандарты.

    Утвердите срок (или событие), после которого следует идти в суд

    Этот срок каждая компания определяет для себя сама. Кто-то решает, что нужно идти в суд через три месяца после возникновения задолженности, кто-то, что через полгода. Многие ориентируются на поведение должника. Например, если он выходит на связь и регулярно перечисляет определенную сумму, арендодатели в такой ситуации зачастую предпочитают отсрочить обращение в суд. Если же должник начинает скрываться и не отвечает на звонки, то самое время переходить к судебной стадии.

    Многие региональные компании считают, что в суд ходить не надо ни при каких обстоятельствах, поскольку это разрушит отношения с клиентом. И в некоторых случаях это оправданная позиция, если, например, речь идет о ключевом игроке регионального рынка. Однако нельзя таким образом относиться ко всем своим клиентам.

    Поиск необходимого оборудования или запчастей стал еще проще – оставьте заявку и Вам перезвонят.

    Контролируйте процесс исполнительного производства

    Одна из самых частых проблем, возникающих при взыскании долгов, – бездействие службы судебных приставов. Опыт “Адвокатской группы Боженко” показывает, что если специалиста компании нет на территории взыскания, если он не приезжает лично в отделение службы судебных приставов, не помогает приставу и не делает часть работы за него (в том числе не проверяет и не добивается, чтобы необходимые документы были составлены правильно, чтобы они дошли до получателя и были зарегистрированы), то процент взыскания будет стремиться к нулю.

    Важно спланировать все необходимые действия еще до получения исполнительного листа и сразу же приступить их осуществлению. Если вы намерены передать работу с долгом внешним специалистам, то определиться в этом вопросе необходимо заранее.

    В сложной ситуации передавайте взыскание долга на аутсорсинг

    Штатные юристы арендных компаний в подавляющем большинстве случаев не являются специалистами по исполнительному производству. При этом исполнительное производство – это очень длительный процесс, юрист может затратить на данный этап в десятки раз больше времени, чем при работе в арбитражном суде по конкретному делу.

    Как уже было сказано в предыдущем пункте, очень важно плотное взаимодействие с ФССП. Если ваши юристы просто будут вести переписку с судебным приставом, то ничего кроме стандартных отписок вы не получите. Узкие специалисты по исполнительному производству всегда лучше знают, как добиться эффективной работы от службы приставов, как и где искать активы должника, как оптимально проводить переговоры. Кроме того, узкоспециализированная компания способна и должна обеспечить постоянное присутствие специалиста в месте нахождения должника, что не всегда возможно обеспечить компании-взыскателю силами штатных юристов.

    Позаботьтесь о профилактике дебиторской задолженности

    Здесь можно выделить следующие основные меры:

    • тщательная проверка контрагента перед началом работы;
    • ежедневный контроль дебиторской задолженности руководителем компании;
    • работа по предоплате (50 или 100-процентной), однако это возможно далеко не всегда;
    • увязывание дебиторской задолженности и заработка менеджера.

    Некоторые арендные компании с целью профилактики плохих долгов не работают за пределами своего региона. Если же поступает запрос от клиента из другого региона, то этот запрос передается партнерской арендной компании.

    Разработайте систему мотивации менеджеров

    При профилактике дебиторской задолженности многое зависит от того, как выстроена система мотивации у менеджеров по продажам. Здесь практика сильно разнится. На одном полюсе находятся компании, где последующее возникновение дебиторской задолженности практически никак не влияет на заработок менеджера, на другом – компании, где возникновение задолженности непосредственным образом сказывается на уровне дохода менеджера и встроено в систему мотивации.

    Но помните, что изменение системы мотивации – вопрос очень чувствительный, к которому нужно подходить обдуманно.

    Воспользуйтесь услугами квалифицированных юристов

    Юридическое сопровождение чрезвычайно важно для профилактики дебиторской задолженности. В некоторых случаях юристы помогают выработать стандарт работы с дебиторской задолженностью.

     

    Вакансии | «Электро-Профи»

    ГК «Электро-Профи» предлагает интересную и динамичную работу для людей готовых развиваться в сфере электротехники.

    ГК «Электро-Профи» уже много лет работает на профессиональном рынке электротехники, мы непрерывно совершенствуем предоставляемые услуги и работаем над их ассортиментом. Не секрет, что «Электро-Профи» ставит перед собой достаточно высокие цели и для их достижения нам требуются целеустремленные, активные и ответственные сотрудники. На базе партнерских и самостоятельных программ регулярно проводятся тренинги и обучение, направленные на повышение квалификации наших сотрудников.

    В нашей Компании Вас ждет дружный и доброжелательный коллектив, готовый помочь Вам в достижении успеха и профессионального роста!

    На этой странице Вашему вниманию представлена информация о текущих открытых вакансиях в нашей компании.

    Просьба, в теме письма укажите, пожалуйста, название вакансии. Требований к оформлению резюме мы не устанавливаем, пусть оно будет в свободной форме – напишите интересно!

    Менеджер по оптовым продажам, г. Москва

    Обязанности:

    • Поиск заказчиков
    • Обработка запросов заказчиков
    • Технические консультации заказчиков
    • Подготовка предложений
    • Подготовка договоров их сопровождение
    • Сопровождение сделок до их закрытия
    • Получать удовольствие от интересной творческой работы в дружелюбном коллективе

    Требования:

    • Опыт продаж электротехники от 2 лет.
    • Высшее техническое образование или среднее специальное
    • Знание основ электротехники
    • Навыки делового общения, коммуникабельность
    • Знание тех.английского или немецкого приветствуется
    • Представление о рынке низковольтного электротехнического оборудования
    • Знание продуктовых линеек каких-либо европейских производителей ABB, Legrand, Moeller, Schneider Electric, Wago, PhoenixContact, Weidmuller, ContaClip – ОБЯЗАТЕЛЬНО !!!!
    • Опыт работы с 1С Торговля, с офисными программами
    • Желание развиваться

    Условия:

    • Возможность реализовать себя, раскрыть свой потенциал и разгадать загадку успеха
    • Работа в компании с более чем 20ти летней историей
    • Оформление в соответствие с ТК РФ
    • Полный рабочий день с 9 до 18.
    • Современный офис в районе м.Бауманская
    • Обучение
    • Заработная плата по итогам собеседования

    Ваши резюме высылайте на почтовый адрес: [email protected] ru


    Инженер-консультант, г. Москва

    Обязанности:

    • Обработка запросов заказчиков
    • Технические консультации заказчиков по поставляемому оборудованию
    • Подготовка предложений
    • Защита технических решений у заказчика
    • Получать удовольствие от интересной творческой работы в дружелюбном коллективе

    Требования:

    • Без опыта работы
    • Высшее техническое образование (или последний курс технического ВУЗа) или среднее специальное
    • Знание основ электротехники
    • Навыки открытого дружелюбного общения, коммуникабельность
    • Знание тех.английского или немецкого приветствуется
    • Знание программного обеспечения (MS офис, интернет-приложения) на уровне “уверенного пользователя”.
    • Желание развиваться

    Условия:

    • Возможность реализовать себя, раскрыть свой потенциал и разгадать загадку успеха
    • Оформление в соответствие с ТК РФ
    • Полный рабочий день с 9 до 18
    • Возможна частичная занятость и гибкий график на время учебы
    • Дружный коллектив
    • Современный офис в районе м. Бауманская
    • Обучение
    • Заработная плата по итогам собеседования
    • Возможна частичная занятость.

    Ваши резюме высылайте на почтовый адрес: [email protected]


    Инженер по проектным продажам, г. Москва

    Обязанности:

    • Поиск проектов
    • Взаимодействие с подрядчиками
    • Подготовка решений и внедрение
    • Технические консультации
    • Подготовка предложений
    • Выезды на территорию заказчиков, участие в совещаниях
    • Подготовка договоров их сопровождение
    • Сопровождение сделок до их закрытия

    Требования:

    • Опыт продаж электротехники от 3-х лет.
    • Высшее техническое образование или среднее специальное
    • Знание основ электротехники
    • Знание основ законодательства в привязке к коммерческим договорам
    • Навыки делового общения, коммуникабельность
    • Знание тех. английского или немецкого приветствуется
    • Представление о рынке низковольтного электротехнического оборудования
    • Знание продуктовых линейки (линеек) каких-либо европейских производителей ABB, Legrand, Moeller, Schneider Electric, Wago, PhoenixContact, Weidmuller, ContaClip приветствуется
    • Опыт работы с 1С Торговля, продвинутый пользователь офисных программ
    • Желание развиваться

    Ваши резюме высылайте на почтовый адрес: [email protected]


    Менеджер развития продаж, г. Самара

    Обязанности:

    • Поиск заказчиков
    • Обработка запросов заказчиков
    • Технические консультации заказчиков
    • Подготовка предложений
    • Подготовка договоров их сопровождение
    • Сопровождение сделок до их закрытия
    • Получать удовольствие от интересной творческой работы в дружелюбном коллективе

    Требования:

    • Опыт продаж электротехники от 2 лет.
    • Высшее техническое образование или среднее специальное
    • Знание основ электротехники
    • Навыки делового общения, коммуникабельность
    • Знание тех.английского или немецкого приветствуется
    • Представление о рынке низковольтного электротехнического оборудования
    • Знание продуктовых линеек каких-либо европейских производителей ABB, Legrand, Moeller, Schneider Electric, Wago, PhoenixContact, Weidmuller, ContaClip – ОБЯЗАТЕЛЬНО !!!!
    • Опыт работы с 1С Торговля, с офисными программами
    • Желание развиваться

    Условия:

    • Возможность реализовать себя, раскрыть свой потенциал и разгадать загадку успеха
    • Работа в компании с более чем 20-ти летней историей
    • Оформление в соответствие с ТК РФ
    • Полный рабочий день с 9 до 18.
    • Современный офис
    • Обучение
    • Заработная плата по итогам собеседования

    Ваши резюме высылайте на почтовый адрес: Boris. [email protected]


    Администратор отдела продаж, г. Самара

    Обязанности:

    • Просчёт входящих заявок и подготовка КП, выставление счетов
    • Оформление комплекта документов при выполнении и отправке заказа клиенту
    • Организация отгрузок, контроль доставки в соответствии с условиями договора
    • Информирование о новинках и акциях клиентов
    • Ведение учетно-отчетной документации и электронной базы данных

    Требования:

    • Высшее техническое образование или среднее специальное
    • Знание основ электротехники
    • Навыки делового общения, коммуникабельность
    • Представление о рынке низковольтного электротехнического оборудования
    • Знание продуктовых линеек каких-либо европейских производителей ABB, Legrand, Moeller, Schneider Electric, Wago, PhoenixContact, Weidmuller, ContaClip
    • Опыт работы с 1С Торговля, с офисными программами
    • Желание развиваться

    Условия:

    • Оформление в соответствие с ТК РФ
    • Полный рабочий день с 9 до 18
    • Современный и оборудованный офис
    • Обучение внутри компании (в т. ч. возможны поездки на производство-экскурсии)
    • Оформление по ТК со дня первого выхода на работу
    • Заработная плата по итогам собеседования

    Ваши резюме высылайте на почтовый адрес: [email protected]


    Менеджер развития продаж, г. Волгоград

    Обязанности:

    • Поиск и привлечение новых клиентов
    • Ведение переговоров на уровне ЛПР
    • Ведение сделки от заявки до отгрузки
    • Работа с проектами
    • Реализация оборудования
    • Работа с ПДЗ
    • Информирование и обработка клиентской базы
    • Командировки (по необходимости)

    Требования:

    • Высшее образование или среднее специальное (техническое – желательно)
    • Знание основ электротехники – обязательно
    • Навыки делового общения, коммуникабельность
    • Представление о рынке низковольтного электротехнического оборудования – обязательно
    • Знание продуктовых линеек каких-либо европейских производителей ABB, Legrand, Moeller, Schneider Electric, Wago, PhoenixContact, Weidmuller, ContaClip
    • Опыт работы с 1С Торговля, с офисными программами
    • Желание развиваться

    Условия:

    • Современный офис, наличие собственного оборудованного рабочего места
    • Обучение внутри компании и на территории производителей (при необходимости) в т. ч. в головном офисе г. Москва
    • Оформление в соответствии с ТК РФ
    • Полный рабочий день с 9 до 18 (в т.ч. обеденный перерыв), отпуск в соответствии с ТК
    • Реальная возможность карьерного роста и развитие
    • Испытательный срок 3 месяца

    Ваши резюме высылайте на почтовый адрес: [email protected]


    Менеджер по продажам, г. Воронеж

    Обязанности:

    • Поиск и привлечение новых клиентов
    • Ведение переговоров на уровне ЛПР
    • Ведение сделки от заявки/поиска клиента с «нуля» до отгрузки
    • Работа с проектами
    • Реализация оборудования
    • Работа с ПДЗ
    • Информирование и обработка клиентской базы
    • Поездки в командировки

    Условия:

    • Современный офис по адресу: г. Воронеж, ул. Дружинников, д. 5б, пом. 15. Наличие собственного оборудованного рабочего места
    • Обучение внутри компании и на территории производителей (при необходимости) в т. ч. в головном офисе г. Москва
    • Оформление в соответствии с ТК РФ
    • Полный рабочий день с 9 до 18 (в т.ч. обеденный перерыв), отпуск в соответствии с ТК
    • Реальная возможность карьерного роста и развитие

    Требования:

    • Высшее техническое образование или среднее специальное
    • Знание основ электротехники
    • Навыки делового общения, коммуникабельность
    • Представление о рынке низковольтного электротехнического оборудования
    • Знание продуктовых линеек каких-либо европейских производителей ABB, Legrand, Moeller, Schneider Electric, Wago, PhoenixContact, Weidmuller, ContaClip
    • Опыт работы с 1С Торговля, с офисными программами
    • Желание развиваться

    Ваши резюме высылайте на почтовый адрес: [email protected]


    Руководитель филиала г. Екатеринбург

    Обязанности:

    • Поиск и привлечение новых клиентов
    • Ведение переговоров на уровне ЛПР
    • Ведение сделки от заявки/поиска клиента с «нуля» до отгрузки
    • Работа с проектами
    • Реализация оборудования
    • Работа с ПДЗ
    • Информирование и обработка клиентской базы
    • Поездки в командировки (по согласованию)
    • Прохождение обучения
    • Руководство офисом, складом

    Условия:

    • Современный офис и склад по адресу: г. Екатеринбург, Сибирский Тракт, д. 12, стр. 8
    • Обучение внутри компании и на территории производителей (при необходимости) в т.ч. в головном офисе г. Москва
    • Оформление в соответствии с ТК РФ
    • Полный рабочий день с 9 до 18 (в т.ч. обеденный перерыв), отпуск в соответствии с ТК

    Требования:

    • Опыт продаж электротехники от 2 лет
    • Высшее техническое образование или среднее специальное
    • Знание основ электротехники
    • Навыки делового общения, коммуникабельность
    • Знание тех. английского или немецкого приветствуется
    • Представление о рынке низковольтного электротехнического оборудования – ОБЯЗАТЕЛЬНО!!!
    • Знание продуктовых линеек каких-либо европейских производителей ABB, Legrand, Moeller, Schneider Electric, Wago, PhoenixContact, Weidmuller, ContaClip – ОБЯЗАТЕЛЬНО!!!
    • Опыт работы с 1С Торговля, с офисными программами

    Ваши резюме высылайте на почтовый адрес: [email protected] ru


    Менеджер развития продаж по УрФО (Уральскому Федеральному Округу), г. Екатеринбург

    Обязанности:

    • Поиск и привлечение новых клиентов
    • Ведение переговоров на уровне ЛПР
    • Ведение сделки от заявки до отгрузки
    • Работа с проектами
    • Реализация оборудования
    • Работа с ПДЗ
    • Информирование и обработка клиентской базы
    • Поездки в командировки по Свердловской обл., Челябинской обл., Пермской обл., ХМАО (если на своем автомобиле, то компенсация ГСМ + амортизация)

    Требования:

    • Высшее образование или среднее специальное (техническое – желательно)
    • Знание основ электротехники – обязательно
    • Навыки делового общения, коммуникабельность
    • Представление о рынке низковольтного электротехнического оборудования- обязательно
    • Знание продуктовых линеек каких-либо европейских производителей ABB, Legrand, Moeller, Schneider Electric, Wago, PhoenixContact, Weidmuller, ContaClip
    • Опыт работы с 1С Торговля, с офисными программами
    • Желание развиваться

    Условия:

    • Современный офис с БЦ Деловой Квартал, наличие собственного оборудованного рабочего места
    • Обучение внутри компании и на территории производителей (при необходимости) в т. ч. в головном офисе г. Москва
    • Оформление в соответствии с ТК РФ
    • Полный рабочий день с 9 до 18 (в т.ч. обеденный перерыв), отпуск в соответствии с ТК
    • Реальная возможность карьерного роста и развитие

    Ваши резюме высылайте на почтовый адрес: [email protected]

    Руководство Компании подробно знакомится с каждым резюме.

    наведи порядок, собери долги! – Учебный центр Группы “Интерфакс”

    Практический тренинг. Участие платное. Подписчикам СПАРК – специальные условия!

    Учебный центр Группы “Интерфакс” выступает партнером практического тренинга “Управление дебиторкой: наведи порядок, собери долги!” и приглашает всех желающих принять в нем участие.

    Научитесь управлять дебиторкой так, чтобы сохранить и деньги, и Клиентов!

    Что такое дебиторская задолженность?

    Для одних компаний – это источник вечной головной боли, проблем и убытков. Для других – это эффективный инструмент увеличения продаж и повышения лояльности своих клиентов (за счет предоставления отсрочки платежа). В работе с дебиторской задолженностью всегда принимают участие сотрудники различных подразделений:

    • коммерческая служба в лице отдела продаж,
    • служба безопасности, выполняющая проверку контрагентов,
    • юристы и финансовая служба.

    От того, насколько четко выстроены бизнес-процессы взаимодействия между данными подразделениями, напрямую зависит вероятность возникновения просроченного долга и шансы этот долг потом вернуть.

    Дебиторской задолженностью надо управлять. А для этого необходимо выстроить работу с дебиторкой как комплексный бизнес-процесс, охватывающий все подразделения компании, имеющий четко прописанные процедуры.

    В ходе данного тренинга мы разберем:

    • Алгоритм, за счет которого удалось сократить среднее время возврата ПДЗ более чем в 4 раза и увеличил процент успешно возвращенных долгов в 1,5 раза.
    • Технологию проверки благонадежности контрагентов и их последующий мониторинг: от “классических” ресурсов и инструментов, до нестандартных методов сбора информации.
    • Как за 1 год можно сэкономить компании 20 млн.р. только на стоимости денег, привлеченных для финансирования дебиторки?
    • Типичные ошибки, которые могут привести к возникновению невозвратной дебиторки и способы их устранения.
    • Как получать неустойку и сохранять хорошие отношения с Клиентом?
    • Готовый пошаговый бизнес-процесс работы с дебиторской задолженностью на примере торговой компании, регламентирующий взаимодействие между различными подразделениями.
    • Как оценивать эффективность бизнес-процесса и, самое главное, как заставить его работать?
    • Как работать с отсрочкой платежа и возвращать долги в условиях кризиса и пандемии?

    Это обновленная и расширенная программа тренинга, который успешно проводится на базе Учебного центра Группы “Интерфакс” с 2017 года. Получить программу тренинга

    Главная задача мероприятия – дать участникам практические инструменты и работающие алгоритмы, достаточные для самостоятельного построения системы управления дебиторской задолженностью у себя в компании.

    Автор тренинга:

    Отзывы участников прошлых тренингов:


    Дополнительная информация:

    • Даты тренинга: 22 и 23 апреля 2021 года. Длительность тренинга составляет 16 академических часов. Возможно два формата участия: очное участие в г. Москва или онлайн участие (трансляция).
    • Уникальный комплект методических материалов.
    • Специализированные именные сертификаты от Учебного центра Группы “Интерфакс”.
    • Подписчикам СПАРК – в подарок возможность участия второго сотрудника от Компании в онлайн формате (два человека по цене одного).

    И самое главное – инструменты, которые мы разбираем в ходе курса работают, и участникам после тренинга удается качественно изменить подход к работе с дебиторкой у себя в компании!

    По вопросам регистрации, стоимости и программы тренинга обращайтесь к организаторам:
    Соловьева Надежда
    тел. : +7 916 983 27 21
    e-mail: [email protected]
    https://prodebitorku.ru/

    Безопасность | Стеклянная дверь

    Пожалуйста, подождите, пока мы проверим, что вы реальный человек. Ваш контент появится в ближайшее время. Если вы продолжаете видеть это сообщение, отправьте электронное письмо чтобы сообщить нам, что у вас возникли проблемы.

    Veuillez терпеливейший кулон Que Nous vérifions Que Vous êtes une personne réelle. Votre contenu s’affichera bientôt. Si vous continuez à voir ce сообщение, связаться с нами по адресу Pour nous faire part du problème.

    Bitte warten Sie, während wir überprüfen, dass Sie wirklich ein Mensch sind.Ихр Inhalt wird в Kürze angezeigt. Wenn Sie weiterhin diese Meldung erhalten, Информировать Sie uns darüber bitte по электронной почте и .

    Эвен Гедульд А.У.Б. terwijl мы verifiëren u een человек согнуты. Uw содержание wordt бинненкорт вергегевен. Als u dit bericht blijft zien, stuur dan een электронная почта naar om ons te informeren по поводу ваших проблем.

    Espera mientras verificamos Que eres una persona real. Tu contenido se sostrará кратко. Si continúas recibiendo este mensaje, информация о проблемах enviando электронная коррекция .

    Espera mientras verificamos Que eres una persona real. Tu contenido aparecerá en краткий Si continúas viendo este mensaje, envía un correo electronico a пункт informarnos Que Tienes Problemas.

    Aguarde enquanto confirmamos que você é uma pessoa de verdade. Сеу контеудо será exibido em breve. Caso continue recebendo esta mensagem, envie um e-mail para Para Nos Informar Sobre O Problema.

    Attendi mentre verificiamo che sei una persona reale.Il tuo contenuto verra кратко визуализировать. Se continui a visualizzare questo message, invia удалить все сообщения по электронной почте indirizzo для информирования о проблеме.

    Включите Cookies и перезагрузите страницу.

    Этот процесс автоматический. Вскоре ваш браузер перенаправит вас на запрошенный вами контент.

    Подождите до 5 секунд…

    Перенаправление…

    Код: CF-102/6efb3921cf8c9db6

    Безопасность | Стеклянная дверь

    Пожалуйста, подождите, пока мы проверим, что вы реальный человек.Ваш контент появится в ближайшее время. Если вы продолжаете видеть это сообщение, отправьте электронное письмо чтобы сообщить нам, что у вас возникли проблемы.

    Veuillez терпеливейший кулон Que Nous vérifions Que Vous êtes une personne réelle. Votre contenu s’affichera bientôt. Si vous continuez à voir ce сообщение, связаться с нами по адресу Pour nous faire part du problème.

    Bitte warten Sie, während wir überprüfen, dass Sie wirklich ein Mensch sind. Ихр Inhalt wird в Kürze angezeigt.Wenn Sie weiterhin diese Meldung erhalten, Информировать Sie uns darüber bitte по электронной почте и .

    Эвен Гедульд А. У.Б. terwijl мы verifiëren u een человек согнуты. Uw содержание wordt бинненкорт вергегевен. Als u dit bericht blijft zien, stuur dan een электронная почта naar om ons te informeren по поводу ваших проблем.

    Espera mientras verificamos Que eres una persona real. Tu contenido se sostrará кратко. Si continúas recibiendo este mensaje, информация о проблемах enviando электронная коррекция .

    Espera mientras verificamos Que eres una persona real. Tu contenido aparecerá en краткий Si continúas viendo este mensaje, envía un correo electronico a пункт informarnos Que Tienes Problemas.

    Aguarde enquanto confirmamos que você é uma pessoa de verdade. Сеу контеудо será exibido em breve. Caso continue recebendo esta mensagem, envie um e-mail para Para Nos Informar Sobre O Problema.

    Attendi mentre verificiamo che sei una persona reale.Il tuo contenuto verra кратко визуализировать. Se continui a visualizzare questo message, invia удалить все сообщения по электронной почте indirizzo для информирования о проблеме.

    Включите Cookies и перезагрузите страницу.

    Этот процесс автоматический. Вскоре ваш браузер перенаправит вас на запрошенный вами контент.

    Подождите до 5 секунд…

    Перенаправление…

    Код: CF-102/6efb3926ef0335a7

    Поиск аллостерических сетей в доменах PDZ | Белковая инженерия, дизайн и выбор

    Аннотация

    С тех пор, как Ранганатан и его коллеги подвергли статистическому корреляционному анализу ковариацию аминокислотных остатков в семействе доменов постсинаптической плотности-95/больших дисков/Zonula occludens 1 (PDZ), домены PDZ представляют собой парадигматическое семейство для изучения аллостерии однодоменных белков. .Тем не менее, несколько теоретических и экспериментальных исследований за последние два десятилетия дали противоречивые результаты в отношении структурной локализации аллостерических сетей или даже поставили под сомнение их фактическое существование в доменах PDZ. В этом обзоре мы сначала описываем теоретические и экспериментальные подходы, которые использовались для исследования энергетической сети (сетей) в доменах PDZ. Затем мы сравниваем предложенные сети для двух хорошо изученных доменов PDZ, а именно третьего домена PDZ из PSD-95 и второго домена PDZ из PTP-BL.Наш анализ подчеркивает противоречие между различными методами и требует дополнительной работы, чтобы лучше понять эти аллостерические явления.

    Введение

    Концепция аллостерического взаимодействия была предложена Umbarger et al. в 1956 г., который обнаружил ингибирование L-треоноиндезаминазы L-изолейцином по типу обратной связи (Umbarger and Brown, 1956). Термин «аллостерия» был введен вскоре после этого Чанже и его коллегами и описан как эффект, возникающий в белках с несколькими субъединицами, характеризующийся наблюдаемым конформационным изменением четвертичной структуры при связывании лиганда (Monod et al. , 1963, 1965; Changeux, 2011). За последние шестьдесят лет эксперименты и вычислительные исследования расширили это определение до феномена, демонстрирующего дистальные изменения при связывании субстрата или лиганда, которые не только наблюдаются на уровне четвертичной или третичной структуры, но даже проявляются как изменение динамики (Cooper and Dryden, 1984; Нусинов и Цай, 2015). Следуя этому расширенному определению, аллостерия была описана в мономерных белках как между белковыми доменами, так и внутри них (Cui and Karplus, 2008).Используя различные подходы, были предложены подмножества остатков, участвующих в распространении энергии через белок («аллостерические сети») после связывания лиганда. Описание таких аллостерических сетей в белках и методы их оценки были недавно подробно рассмотрены Дохоляном (Дохолян, 2016). Здесь мы сосредоточимся на семействе белковых доменов постсинаптической плотности-95/Большие диски/Zonula occludens 1 (PDZ), которое появилось в качестве парадигматической модельной системы для внутридоменной аллостерии благодаря работе Ранганатана и его сотрудников, в которой пути энергетически связанных аминокислотных кислотные остатки были идентифицированы путем изучения совместно эволюционирующих остатков (Lockless and Ranganathan, 1999; Reynolds et al. , 2011; Маклафлин и др. , 2012). Интересно, что теоретические, а также экспериментальные результаты противоречивы, и нет единого мнения относительно природы и роли предлагаемых сетей. В следующих разделах мы кратко опишем домены PDZ и некоторые из различных методов, используемых для характеристики аллостерических сетей, и попытаемся выделить основные результаты, а также очевидные противоречия.

    PDZ-домены

    домена PDZ представляют собой модули белок-белкового взаимодействия, участвующие в динамической регуляции сигнальных путей и строительных каркасов (van Ham and Hendriks, 2003; Kim and Sheng, 2004; Ye and Zhang, 2013).Впервые они были обнаружены в синапсах нервной системы млекопитающих в начале 1990-х годов (Cho et al. , 1992) и в настоящее время считаются одним из наиболее распространенных белковых доменов у эукариот. геном (Luck et al. , 2012). Обычно они входят в состав мультидоменных белков и могут образовывать супрамодули либо из нескольких доменов PDZ (Ye and Zhang, 2013), либо с другими доменами. Домены PDZ имеют консервативную укладку, состоящую из шести бета-цепей (β1–β6) и двух альфа-спиралей (α1 и α2).β2 и α2 образуют неглубокий связывающий карман, в котором пептид-лиганд располагается в виде антипараллельной β-цепи с β2 (Doyle et al. , 1996). Соединительная петля между β1 и β2 содержит консервативную последовательность Gly-Leu-Gly-Phe, называемую карбоксилат-связывающим мотивом, поскольку она стабилизирует концевую карбоксильную группу белкового лиганда посредством водородных связей от основной цепи (Pedersen et al. , 2014). Этот мотив очень консервативен и является определяющей особенностью при прогнозировании доменов PDZ из баз данных последовательностей.Домены PDZ обычно связывают C-концевые хвосты из четырех-пяти остатков других белков с предпочтением, основанным на последовательности. Была предложена классификация, основанная на специфичности пептидного лиганда, но в целом эти специфичности перекрываются (Kang et al. , 2003). Значительное количество доменов PDZ имеют структурированные расширения, например. третий домен PDZ PSD-95 (PSD-95 PDZ3; Cooper and Dryden, 1984), второй домен PDZ NHERF1 (NHERF1 PDZ2; Bhattacharya et al. , 2010), домен PDZ нейрональной синтазы оксида азота ( nNOS PDZ, Tochio и др., 2000), третий домен PDZ ZO-1 (Pan et al. , 2011) и первый домен PDZ гармонина (harmonin PDZ1; Yan et al. , 2010). Предполагается, что эти расширения (1) влияют на модуляцию аффинности связывания мишени на основе динамики белков, (2) обеспечивают сайты связывания для сборки макромолекул, (3) модулируют структурную интеграцию многодоменных модулей и (4) расширяют лиганд-связывающий карман мишени. Купер и Драйден, 1984). NHERF1 PDZ2 и PSD-95 PDZ3 имеют α-спиральное удлинение (α3), которое способствует стабильности (Wang et al., 2010; Готье и др. , 2017) и связывание лиганда (Chi et al. , 2012), и предполагается, что он играет аллостерическую роль, поскольку динамика боковой цепи изменяется во всем PSD-95 PDZ3 путем удаления α3 (Petit et al. , 2009).

    Методы характеристики аллостерии в доменах PDZ

    За последние два десятилетия домены PDZ стали классической модельной системой для изучения аллостерии с (например, NHERF1 PDZ2) и без (например, PSD-95 PDZ3) конформационными изменениями.Предполагается, что аллостерия действует через сети взаимодействий между аминокислотными остатками. Тогда энергия взаимодействия между остатками в сети (сетях) будет определять сеть. Несколько вычислительных и экспериментальных подходов использовались для оценки наличия и характера энергетических сетей в доменах PDZ. Мы начнем с описания вычислительных подходов, таких как анализ статистической связи (SCA), анализ прямой связи (DCA) и сканирование жестких остатков (RRS), которые часто используются для компьютерного прогнозирования аллостерических сетей.Затем мы описываем такие методы, как релаксация ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и анализ двойного мутантного цикла (DMC), которые можно использовать для экспериментального картирования аллостерических сетей.

    Вычислительные подходы

    Несколько подходов к выравниванию последовательностей: анализ статистического связывания

    В 1997 г. Lockless и Ranganathan (1999) предложили статистически прогнозировать сети аллостерических остатков с помощью множественного выравнивания последовательностей (MSA). Этот метод основан на принципе коэволюции, который постулирует, что если два остатка зависят друг от друга в обеспечении стабильности, структуры или функции белка, и если один из них мутирует, соответствующий взаимодействующий остаток также будет мутировать, чтобы гарантировать сохранение его взаимодействия.Следуя этому предположению, сеть связанных остатков может сохраняться в процессе эволюции внутри семейства белков. Действительно, MSA можно использовать для предсказания третичной структуры белков (Rost and Sander, 1993) или уточнения структур, предсказанных другими методами, показывая, что пространственная близость боковых цепей приводит к коэволюции (Anishchenko et al. , 2017). Lockless и др. применили статистический ковариационный анализ (SCA) к выравниванию 274 последовательностей доменов PDZ и обнаружили, что статистически консервативные связанные остатки были частью разреженной энергетической сети, опосредующей связывание пептидного лиганда посредством аллостерического процесса.На основании результатов они предложили общую термодинамическую аллостерическую сеть для семейства PDZ, в которой были идентифицированы три кластера остатков, энергетически связанных с h472; первый кластер находится в ближайшем окружении h472 (G322, G329, A376 и K380), второй кластер остатков участвует в распознавании лиганда (F325 и G322), а третий кластер представляет дистальные остатки, связанные с h472 через F329 (A347, Л353, В362, В386). Разработка подхода SCA вызвала интенсивные исследования по выяснению аллостерических остатков в доменах PDZ (Reynolds et al., 2011; Маклафлин и др. , 2012) и другие белки (Shulman et al. , 2004; Socolich et al. , 2005).

    Подход подвергался критике с разных сторон (Фодор и Олдрич, 2004; Анищенко и др. , 2017). Например, эксперименты по связыванию не могли воспроизвести исходные экспериментальные данные (Chi et al. , 2008), и было показано, что пространственная близость объясняет большую часть эволюционной ковариации в других семействах белков (Anishchenko et al., 2017). Тем не менее, ясно, что работа лаборатории Ранганатана позволила инициировать интенсивные междисциплинарные исследования по этой теме.

    Несколько подходов к выравниванию последовательностей: анализ прямого связывания

    DCA представляет собой второй подход, использующий MSA для картирования остатков, находящихся в тесном контакте либо внутри структуры, либо между субъединицами, либо при белок-белковом взаимодействии. Метод требует двух шагов: (1) идентификация коррелированных остатков, полученных в результате ковариационного анализа с помощью MSA с использованием моделирования максимальной энтропии, и (2) разделение прямых и косвенных взаимодействий из исходных данных корреляции. Разделение прямой и косвенной корреляции (Моркос и др. , 2011) является преимуществом метода по сравнению с простым корреляционным анализом (Анищенко и др. , 2017). Таким образом, DCA идентифицирует пары остатков, проксимальные в пространстве в свернутом белке (Weigt et al. , 2009), что повышает точность карты контактов, используемой для структурного предсказания исключительно из последовательностей. Следовательно, сила DCA заключается в предсказании непосредственно структурно связанных остатков. Напротив, SCA предсказывает как дистальные, так и проксимальные связанные остатки (Lockless and Ranganathan, 1999).Несмотря на то, что эти два подхода используют MSA в качестве входных данных, они не обязательно предсказывают одни и те же пары близко контактирующих остатков, поскольку SCA использует кластерный анализ, тогда как DCA использует моделирование с максимальной энтропией, как показано сравнением предсказаний DCA и SCA для сериновых протеаз (Morcos ). и др. , 2011). Следовательно, важно знать, что DCA и SCA могут извлекать разные пары совместно эволюционирующих остатков. Бейкер и его коллеги проверили достоверность подходов MSA для прогнозирования совместной пространственной или прямой пары остатков (Анищенко et al., 2017). Они использовали 3883 белка, которые имеют не менее 1000 различных последовательностей в базе данных для анализа MSA. Основываясь на исследовании, они предполагают, что эволюционно связанные пары остатков являются пространственно проксимальными либо внутри, либо между белковыми доменами. Они также проверили идею о том, что пространственно разделенные остатки связаны, если они являются частью аллостерической сети. Однако они видят мало доказательств дальнодействующей аллостерической связи для пар остатков, как это было предложено SCA, и существование консервативных аллостерически связанных пар остатков остается предметом обсуждения (Süel et al., 2003; Джанни и др. , 2011; Хультквист и др. , 2013; Анищенко и др. , 2017).

    Сканирование глубокой муфты
    Подходы

    MSA часто используются для определения внутреннего паттерна энергетически или структурно связанных остатков в семействе белков. Однако такие теоретические подходы имеют тот недостаток, что их трудно и дорого проверить экспериментально. Недавно Ранганатан и его коллеги сообщили о тематическом исследовании семейства PDZ, которое экспериментально подтвердило структуру коэволюционных аминокислот, предсказанную SCA (Salinas and Ranganathan, 2018).Сканирование глубокого связывания (DCS) (Olson et al. , 2014), подход расширенного глубокого мутагенеза, применяли к девяти остаткам спирали α2 в пяти гомологах PDZ. В ходе исследования они создали библиотеку всех одиночных и двойных мутантов и исследовали влияние на связывание каждого варианта с помощью бактериального двухгибридного анализа. Каждый мутант количественно оценивали по относительному обогащению роста клеток путем глубокого секвенирования до и после отбора. В анализе связывание лиганда PDZ индуцирует транскрипцию репортерного гена, который обеспечивает рост в присутствии антибиотика.DCS применяли только к небольшой части домена PDZ (α2) из-за экспоненциального распространения мутантов с длиной последовательности. Из-за высокой корреляции между экспериментом с DCS и теоретическими данными DCA или SCA авторы предположили, что DCS является эталоном для будущих испытаний и проверки теоретических моделей функции белка. Авторы пришли к выводу, что MSA является действительным методом обнаружения внутридоменных аллостерических путей без необходимости проведения экспериментов, если математические принципы SCA (энергетического) и DCA (контактного) унифицированы.

    Анизотропная термодиффузия

    Ота и Агард разработали метод молекулярной динамики, анизотропную термодиффузию (ATD), для исследования остатков горячих точек, вовлеченных во внутримолекулярную энергетическую сеть PSD-95 PDZ3. ATD — это основанный на энергии вычислительный метод, в котором целевой остаток локально нагревается и отслеживается распространение тепла. Его применяли к PSD-95 PDZ3 с использованием His-372 в качестве целевого нагреваемого остатка, и результаты показали путь от His-372 к Ile-341, Ala-347 и Leu-353 через Ile-327 и Phe-325.В этой публикации в качестве третьей точки доступа предлагается Ile-327, причем первыми двумя являются His-372 и Phe-325, уже идентифицированные Lockless et al. (Ота и Агард, 2005).

    Метод оказался дешевым, мощным и дополнительным подходом к экспериментальному картированию внутримолекулярного аллостерического сигнального пути (Burendahl and Nilsson, 2012). Позднее этот подход был применен к пяти доменам PDZ со сходной складкой остова, но с различной последовательностью и специфичностью связывания лиганда (Ho and Agard, 2010). Наблюдалась простая взаимосвязь между вычисленными энергетическими связями и конформационной гибкостью при связывании лиганда в α-спиралях. В тематическом исследовании использовали PTP-BL PDZ2 и PSD-95 PDZ3 с конформационным изменением и без него при связывании лиганда. PSD-95 PDZ3 с жесткими α-спиралями сообщает о связывании между α-спиралью и телом PDZ, тогда как для PTP-BL PDZ2 с гибкими и чувствительными к лиганду α-спиралями связывания не наблюдалось. На основании этих результатов была предложена модель, предполагающая, что α-спирали в доменах PDZ по своей природе динамичны, но динамика снижается, если остатки взаимодействуют на ключевых третичных контактах.

    Сканирование твердых остатков

    RRS — это метод моделирования молекулярной динамики, используемый для систематической идентификации остатков, важных для внутримолекулярной коммуникации (Kalescky et al., 2015). RRS исследует роль каждого остатка в общей динамике белка, выполняя отдельные симуляции для каждой аминокислоты, применяемой с ограничением жесткого тела. Каждый остаток отдельно возмущается «ограничением жесткого тела», что означает, что остаток становится жестким, в то время как остальная часть белка остается гибкой, чтобы выявить его вклад в общую динамику белка. Тепловая карта с матрицей взаимной корреляции для невозмущенных и возмущенных остатков используется в анализе, чтобы позволить идентифицировать две группы остатков с различными функциями: (1) «переключатели», которые необходимы для инициации связывающего эффекта от белковой аллостерии и (2 ) «остатки проводов», которые передают энергию или информацию от сайта связывания к отдаленным местам внутри белка.PSD-95 PDZ3 использовали в качестве тематического исследования для сканирования жестких остатков для определения внутримолекулярной сети. О восьми из девяти идентифицированных остатков в PSD-95 PDZ3 ранее сообщалось другими методами как о важных для внутримолекулярной аллостерической сети: G329, I336, I338, A347, h472, A390, Y397, F400. Недавно метод был расширен за счет энтропийного анализа, чтобы вывести взаимосвязь между каждым остатком и общей динамикой белка для объяснения аллостерического механизма (Kalescky et al. , 2016).Энтропийный анализ был выполнен для каждой симуляции RRS в связанном и несвязанном состоянии, чтобы определить вклад энтропии от каждого остатка. Остаток с ограничением твердого тела теряет все внутренние степени свободы, что увеличивает гибкость в других частях белка, что приводит к общему увеличению энтропии белка в соответствии с принципом Ле Шателье. Этот расширенный метод был применен к PTP-BL PDZ2 в качестве тематического исследования, и 11 ключевых остатков показали значительный энтропийный ответ белка на возмущение твердого тела (Kalescky et al., 2016). Семь из одиннадцати остатков были идентифицированы в предыдущем исследовании ЯМР (Fuentes et al. , 2004) как важные для внутримолекулярной аллостерической сети внутри PTP-BL PDZ2: D15, L18, T28, R31, V40, L78 и T81. . Поэтому авторы предположили, что RRS представляет собой систематический подход к выводу вклада внутренних степеней свободы в каждом остатке в динамику белка и аллостерию.

    Метод корреляции взаимодействия

    Молекулярно-динамический корреляционный анализ взаимодействия — это метод, который показывает концептуальное сходство с исследованиями на основе MSA, но опирается на другую информацию. В то время как подход MSA, предложенный Lockless and Ranganathan (1999), основан на выравнивании белков с гомологичными последовательностями, метод корреляции взаимодействия сравнивает различные конформеры одного белка, полученные с помощью MD (Kong and Karplus, 2009). В частности, матрица корреляции остатков построена из корреляций энергии взаимодействия между парами остаток-остаток в ансамбле белковых конформеров, созданных с помощью наносекундного моделирования MD. Хотя этот метод является более дорогим в вычислительном отношении, было предложено отображать энергетические пути одного белкового домена с более высокой точностью, чем MSA, используемый для SCA, который в основном основан на выравнивании последовательностей.Kong and Karplus (2009) применили метод корреляции взаимодействия к PTP-BL PDZ2 и определили два непрерывных пути взаимодействия. Один путь начинается в месте связывания на нити β2 и проходит вдоль N-конца спирали α1 и примыкающего С-конца петли β1–β2. Другой путь начинается в месте связывания и проходит перпендикулярно цепям β2, β3, β4, β6 и β1 по направлению к противоположной стороне PTP-BL PDZ2.

    Экспериментальные подходы

    ЯМР-релаксация

    Преимущество ЯМР среди экспериментальных подходов состоит в том, что он может измерять как структуру, так и динамику.Таким образом, эксперименты по ЯМР-релаксации использовались для оценки динамики белков и наблюдения за энтропийными аллостерическими процессами (Попович и др. , 2006). Спиновая релаксация 2 H изучает динамику метильных групп боковой цепи белков, тогда как эксперименты по спиновой релаксации 15 N предоставляют информацию о динамике основной цепи. Данные релаксации, соответствующие модели Липари-Сабо, дают два основных параметра, полезных для оценки флуктуаций в пикосекундной-наносекундной шкале времени (Липари и Сабо, 1982).Параметр порядка S 2 представляет собой амплитуду движения связи и изменяется от 0 до 1, где 1 соответствует полной жесткости связи; а параметр τ e указывает время корреляции для движения связи. Другие модели могут использоваться для подгонки данных релаксации, и когда наблюдаемые скорости релаксации высоки, данные должны быть подогнаны с использованием моделей, включая R ex , которые представляют движение в микросекундно-миллисекундной шкале времени (Cooper and Dryden, 1984).Группа Эндрю Ли использовала ЯМР-релаксацию вместе с экспериментами по связыванию и сайт-направленному мутагенезу, чтобы выявить ключевые остатки, участвующие в распространении аллостерических сигналов в PTP-BL PDZ2 и PSD-95 PDZ3 (Fuentes et al. , 2004, 2006; Petit et al. и др. , 2009). Они обнаружили, что дальнодействующие динамические эффекты можно наблюдать непосредственно с помощью ЯМР, и успешно идентифицировали два дистальных кластера: первый расположен в области β4 и β5, а второй — в спирали α1 (Fuentes et al., 2004). Параметры релаксации ЯМР также использовались в качестве ограничений при моделировании молекулярной динамики, выявляя сети остатков, представляющие изменения в динамике и структуре при связывании пептида, например. в PTP-BL PDZ2 (Dhulesia et al. , 2008). Насколько хорошо данные релаксации ЯМР коррелируют с остатками, предложенными SCA? Десять остатков статистически связаны с h472 в соответствии с SCA (Lockless and Ranganathan, 1999). Фуэнтес и др. (2006) протестировали одну соответствующую пару остатков в PTP-BL PDZ2 (H71-I20), но не обнаружили никакой термодинамической связи.Согласно Fuentes et al. , отсутствие связи между этими остатками в PTP-BL PDZ2 является напоминанием о различных возможностях методов: (1) SCA сообщает о тенденциях для всего семейства белков, которые могут не применяться ко всем белкам в одном семействе ( 2) Релаксация ЯМР сообщает о термодинамической связи между двумя остатками на основе исследований мутагенеза в конкретном белке, что может повлиять на сравнение, если одни и те же мутации не используются для проверки эффекта.

    Двойные мутантные циклы
    Анализ

    DMC использует термодинамические циклы для изучения процессов фолдинга и связывания белков и позволяет количественно определить энергетическую связь между любыми двумя остатками. Картер и др. (1984); Horovitz и Fersht (1992) первоначально разработали методологию DMC для исследования внутримолекулярных взаимодействий, но впоследствии метод был успешно использован для изучения межмолекулярных взаимодействий между белком и его лигандом (Schreiber and Fersht, 1996). В анализе DMC свободную энергию связывания белка дикого типа сравнивают с энергиями двух одиночных мутантов в положениях А и В и соответствующего двойного мутанта (оба А и В мутируют). Если влияние одиночных мутаций на термодинамику не сводится к влиянию двойного мутанта, то мы можем определить свободную энергию связи (ΔΔΔGC), которая представляет собой свободную энергию взаимодействия и определяется как разность двойных мутаций. мутант, связывающий свободную энергию, с двумя одиночными мутантами, связывающими свободную энергию.Таким образом, если ΔΔΔGC ≠ 0, два мутантных остатка энергетически связаны. С другой стороны, если влияние одиночных мутаций на термодинамику суммируется с влиянием двойного мутанта, то свободная энергия связи равна нулю, и остатки энергетически не связаны. Подход DMC был применен нашими группами к трем различным доменам PDZ для картирования энергетических сетей и, таким образом, для сравнения гомологичных белков: PTP-BL PDZ2, SAP97 PDZ2 и PSD-95 PDZ3 (Chi et al. , 2008; Gianni и др., 2011; Хультквист и др. , 2013). Наши данные не подтверждают существование эволюционно консервативной сети энергетически связанных остатков. Вместо этого мы наблюдали, что несколько энергетических путей отбираются в пределах одного домена, и отдельные пути активируются специфическими белковыми лигандами, что подчеркивает сложность аллостерии PDZ (Hultqvist et al. , 2013).

    Сравнение энергетических сетей в доменах PDZ

    Благодаря работе Lockless и Ranganathan (1999) были инициированы интенсивные исследования по выяснению сети остатков, вовлеченных в аллостерию доменов PDZ, что привело к многочисленным публикациям, в которых были получены разные результаты. Однако, как подчеркивалось выше, взгляд на различные исследования представляется довольно сложным как из-за различных применяемых методологий, так и из-за различных учитываемых белковых систем. Следовательно, систематический подход к анализу наших текущих знаний о наличии и структурной локализации аллостерических сетей в доменах PDZ потребует критического сравнения одних и тех же белковых систем.

    Двумя хорошо изученными доменами PDZ, которые были подвергнуты нескольким исследованиям их аллостерических сетей, являются PTP-BL PDZ2 и PSD-95 PDZ3.На рис. 1 и 2 представлено графическое представление различных остатков, которые, как было установлено, играют роль в аллостерической сети PTP-BL PDZ2 и PSD-95 PDZ3 соответственно. Примечательно, что просмотр рисунков 1 и 2 показывает, что сравнение аллостерических сетей, выявленных с использованием разных методов, дает разные результаты, причем аллостерические сети зависят от выбора метода, используемого для их обнаружения. Т.о., в то время как некоторые положения горячих точек кажутся устойчивыми, остается идентифицировать четкий набор консервативных дистальных остатков, динамически изменяющихся при связывании лиганда. Кроме того, при объединении всех сетей, ранее упомянутых вместе, предполагается, что более 50% аминокислот как в PTP-BL PDZ2, так и в PSD-95 PDZ3 являются аллостерическими. Это представление предполагает, что, в соответствии с некоторыми недавними наблюдениями (Law et al. , 2017; Hayatshahi et al. , 2018), в случае доменов PDZ аллостерия может включать заметную часть структурной архитектуры домен.

    Рис. 1

    Трехмерная структура канонического домена PDZ, PTP-BL PDZ2.Элементы вторичной структуры маркируются в соответствии со стандартной номенклатурой, используемой в доменах PDZ.

    Рис. 1

    Трехмерная структура канонического домена PDZ, PTP-BL PDZ2. Элементы вторичной структуры маркируются в соответствии со стандартной номенклатурой, используемой в доменах PDZ.

    Рис. 2

    Аллостерические сети в PTP-BL PDZ2, определенные разными подходами. Аллостерические сети, картированные в мышином и человеческом PTP-BL PDZ2 (pdb 1GM1 и pdb 3LNX) различными методами: ( A ) Термодинамический двойной мутантный цикл (Gianni et al. , 2011) ( B ) ЯМР, релаксация (Fuentes et al. , 2006) ( C ) ЯМР, релаксация, в сочетании с моделированием молекулярной динамики (Dhulesia et al. , 2008) (D 9027) ) ЯМР ( 15 N HSQC спектры после титрования) (van den Berk et al. , 2007) ( E ) Сканирование жестких остатков (RRS) (Kalescky et al. , ) () ) Модели машинного обучения (Kalescky et al. , 2016) ( G ) Сеть белковой структуры и модель эластичной сети (PSN-ENM) (Raimondi et al. , 2013) ( H ) Сканирование отклика на возмущение (PRS) (Герек и Озкан, 2011).

    Рис. 2

    Аллостерические сети в PTP-BL PDZ2, определенные разными подходами. Аллостерические сети, картированные в PTP-BL PDZ2 мыши и человека (pdb 1GM1 и pdb 3LNX) различными методами: ( A ) Термодинамический двойной мутантный цикл (Gianni et al. , 2011) ( B ) ЯМР, релаксация ( Fuentes et al. , 2006) ( C ) ЯМР, релаксация в сочетании с моделированием молекулярной динамики (Dhulesia et al., 2008) ( D ) ЯМР ( 15 N HSQC спектры после титрования) (van den Berk et al. , 2007) ( E ) Сканирование твердых остатков (RRS) (Kalescky 9 006et. , 2016) ( F ) Модели машинного обучения (Kalescky et al. , 2016) ( G ) Сеть белковой структуры и модель эластичной сети (PSN-ENM) (Raimondi et al. , 2013) ( H ) Сканирование отклика на возмущение (PRS) (Gerek and Ozkan, 2011).

    Озадачивающий сравнительный результат, представленный на рис. 2 и 3, подчеркивает присущую сложность описания аллостерических сетей в белковом домене.На самом деле, в то время как несколько экспериментальных и вычислительных методов сходятся в подчеркивании роли внутридоменной аллостерии внутри фрагмента PDZ, структурные детали таких эффектов далеки от понимания. Учитывая, что один и тот же домен PDZ может отображать разные сети в зависимости от конкретного лиганда (Hultqvist et al. , 2013), на данном этапе неясно, связаны ли расхождения, наблюдаемые на рис. 2 и 3, с присущими ограничениями различных методов, а не конкретной сложности семейства доменов PDZ.Очевидно, что для понимания этой научной проблемы требуется дополнительная работа, возможно, с участием совместных усилий различных исследовательских групп, применяющих дополнительные экспериментальные и вычислительные методы в одной и той же области.

    Рис. 3

    Рис. 3

    Выводы

    На более общем уровне, что мы можем узнать из обширной работы по энергетическим сетям в доменах PDZ? Понятно, что выбор метода влияет на результат, что, вероятно, является результатом относительно слабой энергетической связности и сложности взаимодействий аминокислотных остатков, вовлеченных в сети.По сравнению, например, со сворачиванием белка, которое относительно устойчиво к возмущениям из-за направленного энергетического ландшафта, аллостерия, опосредованная небольшими конформационными изменениями или изменениями в динамике, кажется менее устойчивой и более склонной к ремоделированию. Поэтому ясно, что понимание таких аллостерических путей требует полного понимания синергии между различными экспериментальными и вычислительными методами.

    Финансирование

    Проект получил финансирование от исследовательской и инновационной программы Horizon 2020 Европейского Союза в рамках соглашения о гранте Марии Склодовской-Кюри №.675341 (для SG и PJ) и частично поддержан грантами от Министерства итальянской промышленности dell’Istruzione dell’Università e della Ricerca (Progetto di Interesse ‘Invecchiamento’ для SG), Римского университета Сапиенца (C26A155S48, B52F16003410005 и RP11715C34AEAC9B для SG) , Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (индивидуальный грант — MFAG 2016, 18701 для SG) и Шведский исследовательский совет (для PJ).

    Ссылки

    Анищенко

    ,

    И.

    ,

    Овчинников

    ,

    С.

    ,

    Камисетты

    ,

    Х.

    и

    Бейкер

    ,

    Д.

    (

    2013

    Pro.909c) Натл. акад. науч. США

    ,

    114

    ,

    9122

    9127

    .

    Bhattacharya

    ,

    S.

    ,

    DAI

    ,

    Z.

    ,

    LI

    ,

    J.

    ,

    Baxter

    ,

    S.

    ,

    Callaway

    ,

    D.J.

    ,

    Коуберн

    ,

    Д.

    и

    Bu

    ,

    Z.

    (

    2010

    )

    J. Biol. хим.

    ,

    285

    ,

    9981

    9994

    .

    Burendahl

    ,

    S.

    и

    Nilsson

    ,

    L.

    (

    2012

    )

    Белки

    ,

    80

    ,

    294

    306

    .

    Картер

    ,

    П.Дж.

    ,

    Винтер

    ,

    Г.

    ,

    Уилкинсон

    ,

    А.Дж.

    и

    Фершт

    ,

    А.р.

    (

    1984

    )

    Сотовый

    ,

    38

    ,

    835

    840

    .

    Changeux

    ,

    J.

    (

    2011

    )

    Protein Sci.

    ,

    20

    ,

    1119

    1124

    .

    Chi

    ,

    C.N.

    ,

    ELFström

    ,

    L.

    ,

    SHI

    ,

    Y.

    ,

    SNÄLL

    ,

    T.

    ,

    Engström

    ,

    A.

    и

    JEMTH

    ,

    P.

    (

    2008

    )

    Проц. Натл. акад. науч. США

    ,

    105

    ,

    4679

    4684

    .

    Chi

    ,

    C.N.

    ,

    Хак

    ,

    С.Р.

    ,

    Rinaldo

    ,

    S.

    ,

    Dogan

    ,

    J.

    ,

    Cutruzzola

    ,

    F.

    ,

    Engström

    , Å

    .

    ,

    Gianni

    ,

    S.

    ,

    Lundström

    ,

    P.

    и

    Jemth

    ,

    P.

    (

    2012

    )

    Биохимия

    ,

    51

    ,

    8971

    8979

    .

    Чо

    ,

    К.О.

    ,

    Охота

    ,

    К.А.

    и

    Кеннеди

    ,

    М.Б.

    (

    1992

    )

    Нейрон

    ,

    9

    ,

    929

    942

    .

    Cooper

    ,

    A.

    и

    Dryden

    ,

    DT

    (

    1984

    )

    Евро. Биофиз. Дж.

    ,

    11

    ,

    103

    109

    .

    Cui

    ,

    Q.

    и

    Karplus

    ,

    M.

    (

    2008

    )

    Protein Sci.

    ,

    17

    ,

    1295

    1307

    .

    Дулесия

    ,

    А.

    ,

    Гспонер

    ,

    Дж.

    и

    Вендрусколо

    ,

    М.

    (

    9.0002 0 ам 20038 90 хим. соц.

    ,

    130

    ,

    8931

    8939

    .

    Дохолян

    ,

    Н.В.

    (

    2016

    )

    Хим.

    ,

    116

    ,

    6463

    6487

    .

    Дойл

    ,

    Д.А.

    ,

    Lee

    ,

    A.

    ,

    Lewis

    ,

    J.

    ,

    KIM

    ,

    E.

    ,

    Sheng

    ,

    М.

    и

    Mackinnon

    ,

    R

    (

    1996

    )

    Сотовый

    ,

    85

    ,

    1067

    1076

    .

    Ду

    ,

    К.С.

    ,

    Ван

    ,

    К.Х.

    ,

    Ляо

    ,

    С.М.

    и

    Хуан

    ,

    РБ

    (

    2010

    )

    PLoS One

    ,

    5

    ,

    e13207

    .

    Фодор

    ,

    А.А.

    и

    Aldrich

    ,

    R.W.

    (

    2004

    )

    J. Biol. хим.

    ,

    279

    ,

    19046

    19050

    .

    Фуэнтес

    ,

    Э.Дж.

    ,

    Der

    ,

    CJ

    и

    Lee

    ,

    AL

    (

    2004

    )

    J. Мол. биол.

    ,

    335

    ,

    1105

    1115

    .

    Фуэнтес

    ,

    Э.Дж.

    ,

    Гилмор

    ,

    С.А.

    ,

    Молдин

    ,

    Р.В.

    и

    Lee

    ,

    A.L.

    (

    2006

    )

    J. Mol. биол.

    ,

    364

    ,

    337

    351

    .

    Gautier

    ,

    C.

    ,

    Visconti

    ,

    L.

    ,

    Jemth

    ,

    P.

    и

    Gianni

    ,

    S.

    (

    2017

    )

    Науч. Респ

    ,

    7

    ,

    12593

    .

    Герек

    ,

    З.Н.

    и

    Озкан

    ,

    С.Б.

    (

    2011

    )

    Вычисл. PLoS. биол.

    ,

    7

    ,

    е10021154

    .

    Джанни

    ,

    С.

    ,

    Хак

    ,

    С.Р.

    ,

    Монтемильо

    ,

    Л.К.

    ,

    Юргенс

    ,

    М.К.

    ,

    Энгстрем

    ,

    Å.

    ,

    Чи

    ,

    С.N.

    ,

    Brunori

    ,

    M.

    и

    Jemth

    ,

    P.

    (

    2011

    )

    J. Biol. хим.

    ,

    286

    ,

    27167

    27175

    .

    Хаятшахи

    ,

    Х. С.

    ,

    Ахуакцин

    ,

    Э.

    ,

    Шоуи Ван

    ,

    П.Т.

    и

    Liu

    ,

    J.

    (

    2018

    ) карты возмущений. БиоРксив 355370 .

    Но

    ,

    Б.К.

    и

    Агард

    ,

    Д.А.

    (

    2010

    )

    Protein Sci.

    ,

    19

    ,

    398

    411

    .

    Горовиц

    ,

    А.

    и

    Фершт

    ,

    А.Р.

    (

    1992

    )

    J. Mol. биол.

    ,

    224

    ,

    733

    740

    .

    Hultqvist

    ,

    G.

    ,

    Haq

    ,

    S.R.

    ,

    Пунекар

    ,

    А.С.

    ,

    Чи

    ,

    С.N.

    ,

    Engström

    ,

    Å.

    ,

    Bach

    ,

    A.

    ,

    strømgaard

    ,

    K.

    ,

    SELMER

    ,

    м.

    ,

    ,

    м.

    ,

    Gianni

    ,

    S.

    и

    JEMTH

    ,

    P.

    (

    2013

    )

    Структура

    ,

    21

    ,

    1193

    1202

    .

    Калески

    ,

    Р.

    ,

    Лю

    ,

    Дж.

    и

    Тао

    ,

    П.

    (

    2015

    ) Дж.физ. хим. А

    ,

    119

    ,

    1801

    1809

    .

    Kalescky

    ,

    R

    ,

    ZHOU

    ,

    H.

    ,

    LIU

    ,

    J.

    и

    TAO

    ,

    P.

    (

    2016

    )

    PLOS Comput. биол.

    ,

    12

    ,

    е1004893

    .

    Кан

    ,

    Б.С.

    ,

    Бондарь

    ,

    Д.Р.

    ,

    Деведжиев

    ,

    Ю.

    ,

    Деревенда

    ,

    Ю.

    и

    Деревенда

    ,

    З.С.

    (

    2003

    )

    Структура

    ,

    11

    ,

    845

    853

    .

    Kaya

    ,

    C.

    ,

    ARMUTLULU

    ,

    ARMUTLULU

    ,

    ARMUTLULU

    ,

    A.

    ,

    EKESAN

    ,

    S.

    и

    HaliLoglu

    ,

    T.

    (

    2013

    )

    Нуклеиновые кислоты Res.

    ,

    41

    ,

    249

    255

    .

    Ким

    ,

    Э.

    и

    Шэн

    ,

    М.

    (

    2004

    )

    Нац. Rev. Nuerosci

    ,

    5

    ,

    771

    781

    .

    Kong

    ,

    Y.

    и

    Karplus

    ,

    M.

    (

    2009

    )

    Белки

    ,

    74

    ,

    145

    154

    .

    Кумават

    ,

    А.

    и

    Чакрабарти

    ,

    С.

    (

    2017

    )

    Proc. Натл. акад. науч. США

    ,

    114

    ,

    E5825

    E5834

    .

    Закон

    ,

    А.Б.

    ,

    Sapienza

    ,

    PJ

    ,

    Zhang

    ,

    J.

    ,

    Zuo

    ,

    X.

    и

    Petit

    , 90.M 90.003

    (

    2017

    )

    Дж. Ам. хим. соц.

    ,

    139

    ,

    3599

    3602

    .

    Липари

    ,

    Г.

    и

    Сабо

    ,

    А.

    (

    1982

    )

    Дж. Ам. хим. соц.

    ,

    104

    ,

    4546

    4559

    .

    Без замка

    ,

    S.W.

    и

    Ранганатан

    ,

    Р.

    (

    1999

    )

    Наука

    ,

    286

    ,

    295

    030 9.

    Удача

    ,

    К.

    ,

    Шарбонье

    ,

    С.

    и

    Траве

    ,

    Г.

    (

    2012 БСт.ФЭ

    )

    ,

    586

    ,

    2648

    2661

    .

    Маклафлин

    ,

    Р. Н.Дж.

    ,

    Пёльвейк

    ,

    Ф.Дж.

    ,

    Раман

    ,

    А.

    ,

    Госал

    ,

    В.С.

    и

    Ранганатан

    ,

    Р.

    (

    2012

    )

    Природа

    ,

    491

    ,

    138

    0142 9.

    Monod

    ,

    J.

    ,

    Changeux

    ,

    J.-P.

    и

    Джейкоб

    ,

    Ф.

    (

    1963

    )

    Дж. Мол. биол.

    ,

    6

    ,

    306

    309

    .

    Моно

    ,

    Дж.

    ,

    Wyman

    ,

    J.

    и

    Changeux

    ,

    J.-P.

    (

    1965

    )

    Дж. Мол. биол.

    ,

    12

    ,

    88

    118

    .

    MORCOS

    ,

    F.

    ,

    Pagnani

    ,

    A.

    ,

    ,

    A.

    ,

    LUT

    ,

    B.

    ,

    Bertolino

    ,

    A.

    ,

    Marks

    ,

    DS

    ,

    Sander

    ,

    К.

    ,

    Зекчина

    ,

    Р.

    ,

    Онучи

    ,

    Дж.№

    ,

    Hwa

    ,

    T.

    и

    Вес

    ,

    M.

    (

    2011

    )

    Proc. Натл. акад. науч. США

    ,

    108

    ,

    E1293

    E1301

    .

    Нусинов

    ,

    Р.

    и

    Цай

    ,

    CJ

    (

    2015

    )

    Курс. мнение Структура биол.

    ,

    30

    ,

    17

    24

    .

    Олсон

    ,

    К.А.

    ,

    Ву

    ,

    Н.C.

    и

    Sun

    ,

    R.

    (

    2014

    )

    Curr. биол.

    ,

    24

    ,

    2643

    2651

    .

    Ота

    ,

    Н.

    и

    Агард

    ,

    Д.А.

    (

    2005

    )

    J. Mol. биол.

    ,

    351

    ,

    345

    354

    .

    Пан

    ,

    Л.

    ,

    Чен

    ,

    Дж.

    ,

    Ю

    ,

    Дж.

    ,

    Ю

    ,

    Х.

    и

    Zhang

    ,

    M.

    (

    2011

    )

    J. Biol. хим.

    ,

    286

    ,

    40069

    40074

    .

    Педерсен

    ,

    С.В.

    ,

    Педерсен

    ,

    С.Б.

    ,

    Анкер

    ,

    Л.

    ,

    Хультквист

    ,

    Г.

    ,

    Кристенсен

    ,

    А.С.

    ,

    Jemth

    ,

    P.

    и

    Strømgaard

    ,

    K.

    (

    2014

    )

    Nat.коммун.

    ,

    5

    ,

    3215

    .

    Пети

    ,

    C.M.

    ,

    Чжан

    ,

    Дж.

    ,

    Сапиенца

    ,

    П.Дж.

    ,

    Фуэнтес

    ,

    Э.Дж.

    и

    Lee

    ,

    AL

    (

    2009

    )

    Proc. Натл. акад. науч. США

    ,

    106

    ,

    18249

    18254

    .

    Попович

    ,

    Н.

    ,

    Вс

    ,

    С.

    ,

    Эбрайт

    ,

    Р.H.

    и

    Kalodimos

    ,

    C.G.

    (

    2006

    )

    Нац. Структура Мол. биол.

    ,

    13

    ,

    831

    838

    .

    Raimondi

    ,

    F.

    ,

    ,

    F.

    ,

    ,

    ,

    ,

    A.

    ,

    Seasber

    ,

    M.

    ,

    Mariani

    ,

    S.

    и

    Fanelli

    ,

    F.

    (

    2013

    )

    J. Chem. Теория вычисл.

    ,

    9

    ,

    2504

    2518

    .

    Рейнольдс

    ,

    К.А.

    ,

    Маклафлин

    ,

    Р.Н.

    и

    Ранганатан

    ,

    Р.

    (

    2011

    )

    Сотовый

    ,

    147

    ,

    1564

    00735 9 00735 15735

    .

    Рост

    ,

    Б.

    и

    Сандер

    ,

    С.

    (

    1993

    )

    Проц. Натл. акад. науч. США

    ,

    90

    ,

    7558

    7562

    .

    Салинас

    ,

    В.H.

    и

    Ranganathan

    ,

    R.

    (

    2018

    )

    Elife

    ,

    7

    ,

    34300

    .

    Шрайбер

    ,

    Г.

    и

    Фершт

    ,

    А.Р.

    (

    1996

    )

    Нац. Структура биол.

    ,

    3

    ,

    427

    431

    .

    Шульман

    ,

    А.И.

    ,

    Ларсон

    ,

    К.

    ,

    Мангельсдорф

    ,

    Д.Дж.

    и

    Ранганатан

    ,

    р.

    (

    2004

    )

    Сотовый

    ,

    116

    ,

    417

    429

    .

    Соколич

    ,

    М.

    ,

    Беззамковый

    ,

    Ю.В.

    ,

    Русь

    ,

    В.П.

    ,

    Ли

    ,

    Х.

    ,

    Гарднер

    ,

    К.Х.

    и

    Ранганатан

    ,

    Р.

    (

    2005

    )

    Природа

    ,

    437

    ,

    512

    030 9.

    Сюэль

    ,

    Г.М.

    ,

    Lockless

    ,

    S.W.

    ,

    Стена

    ,

    M.A.

    и

    Ranganathan

    ,

    R.

    (

    2003

    )

    Nat. Структура биол.

    ,

    10

    ,

    59

    69

    .

    Точио

    ,

    Х.

    ,

    Мок

    ,

    Ю.К.

    ,

    Чжан

    ,

    В.

    ,

    Кан

    ,

    Х.М.

    ,

    Бредт

    ,

    Д.С.

    и

    Чжан

    ,

    М.

    (

    2000

    )

    Дж.Мол. биол.

    ,

    303

    ,

    359

    370

    .

    Умбаргер

    ,

    H.E.

    и

    Браун

    ,

    B.

    (

    1956

    )

    J. Bacteriol.

    ,

    71

    ,

    443

    449

    .

    Ван ден Берк

    ,

    Л.К.

    ,

    Landi

    ,

    E.

    ,

    Walma

    ,

    T.

    ,

    Vuister

    ,

    G.W.

    ,

    Dente

    ,

    L.

    и

    Hendriks

    ,

    W.

    (

    2007

    )

    Биохимия

    ,

    46

    ,

    13629

    13637

    .

    Ван Хэм

    ,

    М.

    и

    Хендрикс

    ,

    В.

    (

    2003

    )

    Мол. биол. Респ.

    ,

    30

    ,

    69

    82

    .

    Ван

    ,

    К.К.

    ,

    PAN

    ,

    L.

    ,

    CHEN

    ,

    J.

    и

    ZHANG

    ,

    м.

    (

    2010

    )

    Белкового элемента

    ,

    1

    ,

    737

    751

    .

    Вес

    ,

    M.

    ,

    Белый

    ,

    R.A.

    ,

    Шурмант

    ,

    Х.

    ,

    Хох

    ,

    Я.А.

    и

    Хва

    ,

    Т.

    (

    2009

    )

    Проц. Натл. акад. науч. США

    ,

    106

    ,

    67

    72

    .

    Ян

    ,

    J.

    ,

    J.

    ,

    PAN

    ,

    Л.

    ,

    Чэнь

    ,

    X.

    ,

    ° С

    ,

    Л.

    и

    Чжан

    ,

    М.

    (

    2010

    )

    Проц. Натл. акад. науч. США

    ,

    107

    ,

    4040

    4045

    .

    Ye

    ,

    F.

    и

    Zhang

    ,

    M.

    (

    2013

    )

    Biochem. Дж.

    ,

    455

    ,

    1

    14

    .

    Примечания автора

    Под редакцией: Валери Даггетт

    © Автор(ы), 2019 г. Опубликовано Oxford University Press.

    Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное повторное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что оригинал работа цитируется правильно.

    Жанин Амашер | Chemistry Department

    Наша исследовательская группа широко интересуется доменами связывания пептидов и тем, как в данном взаимодействии распознается лишь небольшое количество аминокислот.В частности, мы сосредоточены на ряде этих типов доменов, включая бактериальные сортазы и каркасные домены PDZ, Sh3 и Sh4. Например, домен PDZ важен для путей передачи сигналов и транспорта в клетке. В протеоме человека насчитывается более 200 доменов PDZ, что делает его самым большим семейством доменов, связывающих пептиды. Определенные мотивы включают только пару позиций вдоль пептидсвязывающей щели и не точно определяют перекрывающиеся, но четкие предпочтения среди членов семейства.Наша исследовательская группа работает над тем, чтобы понять детерминанты селективности доменов PDZ на протяжении всей эволюции. Мы используем биохимию и структурную биологию для исследования доменов PDZ у современных видов, а также доменов PDZ у хоанофлагеллят. Нас также интересуют детерминанты селективности других пептидсвязывающих доменов, особенно тех, которые имеют структурно-консервативные петли, определяющие специфичность. Наша работа с бактериальными сортазами, например, исследование роли петли бета7-бета8 в селективности и активности, показала, что изменение последовательности этой петли оказывает сильное влияние на функцию белка.В этом проекте мы изучаем химерные ферменты сортаз класса А из семейств Streptococcus (т. е. S. pneumoniae, S. agalactiae, и S. pyogenes ) и Staphylococcus aureus.

  1. Гао М., Макли И.Г.П., Месбахи-Васей С., Бамонте Х.А., Струйвенберг С.А., Ландольт Л., Педерсон Н.Дж., Уильямс Л.И., Бахл К.Д., Брукс 3-й Л., Амахер Дж.Ф. . Структурная характеристика и компьютерный анализ доменов PDZ в Monosiga brevicollis . Науки о белках.   2020 . doi: 10.1002/pro.3947. В печати .

  2. Amacher JF , Brooks 3rd L, Hampton TH, Madden DR. Специфичность в сетях взаимодействия PDZ-пептид: вычислительный анализ и обзор. J Struct Biol X.  2020 . 4:100022.

  3. Валгардсон Дж*, Косби Р*, Хаузер П*, Рупп М, Ван Бронкхорст Р, Ли М, Ягодзински Ф, Амачер ДжФ . MotifAnalyzer-PDZ : вычислительная программа для исследования эволюции целевой специфичности связывания PDZ. Науки о белках.   2019 . 28(12):2127-43. *Эти авторы внесли равный вклад в данное исследование.

  4. Shah NH, Amacher JF , Nocka L, Kuriyan J. Модуль Src: древний каркас в эволюции цитоплазматических тирозинкиназ. Crit Rev Biochem Mol Biol.  2018 . 5 сентября: 1-29. Обзор .

  5. Амачер Дж. Ф. , Хоббс Х. Т., Кантор А. С., Шах Л., Риверо М. Дж., Мулчанд С. А., Куриян Дж.Контроль фосфорилирования убиквитинлигазы Cbl сохраняется у хоанофлагеллят. Белковая наука . 2018 . 27(5): 923-32.

  6. Courtney AH, Amacher JF , Kadlecek TA, Mollenauer MN, Au-Yeung BB, Kuriyan J, Weiss A. Фосфозит в домене Sh3 Lck регулирует его активацию с помощью CD45. молярная ячейка . 2017 . 67(3):498-511

  7. Amacher JF , Zhong F, Lisi GP, Zhu MQ, Alden SL, Hoke KR, Madden DR, Pletneva EV.Компактная структура цитохрома с, захваченного лизин-лигированным состоянием: рефолдинг петли и функциональные последствия конформационного переключателя. J Am Chem Soc . 2015 . 137(26):8435-49.

  8. Qian Z, Xu X, Amacher JF , Madden DR, Cormet-Boyaka E, Pei D. Внутриклеточная доставка пептидильных лигандов путем обратимой циклизации: открытие ингибитора домена PDZ, который восстанавливает активность CFTR. Ангью Хим . 2015 . 54(20):5874-8.

  9. Амачер Дж.Ф. , Чжао Р., Спаллер М.Р., Мэдден Д.Р. Химически модифицированные пептидные каркасы нацелены на домен PDZ лиганда, связанного с CFTR. PLoS Один . 2014 . 9(8):e103650.

  10. Amacher JF , Cushing PR, Brooks L 3rd, Boisguerin P, Madden DR. Стереохимические предпочтения модулируют аффинность и селективность среди пяти доменов PDZ, которые связывают CFTR: сравнительный анализ структуры и последовательности. Структура . 2014 . 22(1):82-93.

  11. Amacher JF , Cushing PR, Bahl CD, Beck T, Madden DR. Стереохимические детерминанты С-концевой специфичности в доменах, связывающих пептиды PDZ: новый вклад петли, связывающей карбоксилат. J Биол Хим . 2013 . 288(7):5114-26.

  12. Белки-хозяева, содержащие PDZ, на которые нацелен SARS-Cov-2

    Abstract

    Небольшой линейный мотив, нацеленный на взаимодействующие с белками домены, называемые PDZ, был идентифицирован на С-конце вируса тяжелого острого респираторного синдрома коронавируса 2 (SARS-CoV-2) белки E, 3a и N.Используя высокопроизводительный подход к профилированию аффинности в отношении полного человеческого PDZome, мы идентифицировали шестнадцать человеческих PDZ-связывающих белков SARS-CoV-2 E, 3A и N, демонстрирующих значительные взаимодействия со значениями констант диссоциации в диапазоне от 3 мкМ до 82 мкМ. Шесть из них (TJP1, PTPN13, HTRA1, PARD3, MLLT4, LNX2) также распознаются SARS-CoV, а три (NHERF1, MAST2, RADIL) специфичны для E-белка SARS-CoV-2. Большинство этих белковых партнеров SARS-CoV-2 участвуют в клеточных соединениях/полярности и могут быть также связаны с механизмами уклонения от иммунных ответов во время вирусной инфекции.Семь из белков, содержащих PDZ, среди связующих белков SARS-CoV-2 E, 3a или N значительно влияют на репликацию вируса при нокдауне экспрессии генов в инфицированных клетках. Это профилирование PDZ, идентифицирующее белки человека, потенциально являющиеся мишенью для SARS-CoV-2, может помочь понять многофакторную тяжесть COVID-19 и разработать эффективные противокоронавирусные средства для терапевтических целей.

    Введение

    Коронавирусы (CoV) представляют собой оболочечные вирусы, которые в основном поражают птиц и млекопитающих.Некоторые CoV эволюционировали, вызывая зоонозные заболевания у людей, потенциально вызывая тяжелые респираторные заболевания [1]. Серьезность инфекции CoV во время последних вспышек, вызванных коронавирусом тяжелого острого респираторного синдрома 1 (SARS-CoV) в 2003 г.; вирус ближневосточного респираторного синдрома (MERS-CoV) в 2012 г. и SARS-CoV-2 в 2020 г. [2], а также отсутствие эффективного лечения инфекции CoV подчеркивают необходимость более глубокого понимания молекулярной биологии коронавируса для разработки терапевтических стратегии, противодействующие инфекции SARS-CoV-2.Однако ограниченное знание молекулярных деталей инфекции SARS-CoV-2 препятствует быстрой разработке соединений, нацеленных на взаимодействие вирус-хозяин. Несколько интерактомов SARS-CoV-2 были недавно опубликованы с использованием масс-спектрометрии [3–5]. К сожалению, некоторые временные и слабые взаимодействия с аффинностью в диапазоне 1-100 мкМ вряд ли могут быть обнаружены такими подходами. Однако во время инфекции вирусы нацелены на сигнальные пути хозяина, которые в основном включают белок-белковые взаимодействия с низким сродством, поскольку временные связывания необходимы для динамики клеточного гомеостаза.

    Захват функций клеточных белков является широко используемой стратегией для вирусов, поскольку они являются облигатными внутриклеточными патогенами. Каждый этап жизненного цикла вируса от проникновения до передачи управляется взаимодействием с клеточными белками. Все семейства вирусов манипулируют клеточным протеомом, нацеливаясь на ключевые белки, участвующие в контроле клеточной защиты и гомеостаза. Взаимодействия, опосредованные короткими линейными мотивами (SLiMs), широко распространены в эукариотическом протеоме [6], а адаптация вирусов к окружающей среде включает широкое использование мимикрии SLiM для подрыва функциональности хозяина [7].

    Мотивы связывания PDZ (PBM) представляют собой SLiM, которые взаимодействуют с большим семейством доменов взаимодействия белков, называемых PDZ (PSD-95/Dlg/ZO-1). PBM обычно располагаются на крайнем карбоксильном конце белков [8]. Интерактом PDZ-PBM является одним из наиболее известных примеров SLiM-опосредованной сети взаимодействия белков, служащей ключевым целям клеточной передачи сигналов [9]. PBM были идентифицированы в различных белках многих вирусов, ответственных за острые и хронические инфекции [10,11]. Было показано, что клеточные взаимодействия PDZ-вируса PBM непосредственно вовлечены в вирусную патогенность SARS-CoV, а также вируса бешенства и в онкогенность вируса папилломы человека (HPV16) [10].Во время инфекции вирусные белки конкурируют с эндогенными лигандами за счет связывания с доменом PDZ белка-мишени хозяина, что обеспечивает клеточную релокализацию, секвестрацию или деградацию белка [12], но также может влиять на каталитическую активность сигнальных белков [13]. Функциональные нарушения клеточных процессов из-за взаимодействия между вирусными PBM и клеточными белками, содержащими PDZ, могут облегчить жизненный цикл вируса в хозяине и распространение среди новых хозяев. Таким образом, нацеливание на интерфейс PBM-PDZ потенциально может привести к новым противовирусным методам лечения.

    Четыре основных структурных белка, кодируемых геномом коронавируса; белок шипа (S), белок нуклеокапсида (N), белок мембраны (M) и белок оболочки (E) участвуют в различных аспектах цикла репликации и в конечном итоге образуют структурно завершенную вирусную частицу. В то время как незначительная часть включена в оболочку вириона, интегральный мембранный белок E (~ 8–12 кДа) CoV, включая SARS-CoV, представляет собой многофункциональный белок, который образует ионные каналы со своим трансмембранным (TM) доменом.Эта активность канала опосредована образованием пентамерных олигомеров и лишь слабо селективна в отношении катионов [14]. Канал будет активен в секреторном пути, изменяя люминальную среду, перестраивая секреторные органеллы и приводя к эффективному переносу вирионов [15]. Кроме того, белок Е взаимодействует с белками-хозяевами, связанными с его экстрамембранным доменом, в частности с С-концевым доменом.

    Предполагается, что С-концевая последовательность в экстрамембранном положении частично свернута (спирали и мотив ß-coil-ß), что может повлиять на глобальную конформацию пентамерного канала E, что позволяет предположить, что активность канала E и его взаимодействие с белком наиболее вероятное взаимодействие [14,16].Кроме того, белок E кодирует предполагаемую последовательность PBM на своем крайнем С-конце (Fig. 1A), которая также может мешать посредством белок-белковых взаимодействий олигомерной организации белка E и, следовательно, его канальной активности. Последовательность PBM белка E была идентифицирована как фактор вирулентности вируса SARS-CoV, влияющий на уровень репликации, распространение вируса и патогенность SARS-CoV на животных моделях [17]. На сегодняшний день сообщалось, что белок E SARS-CoV взаимодействует только с пятью белками-хозяевами; Bcl-xL, PALS1/MPP5, синтенин, субъединица а1 натрий/калиевой АТФазы и стоматин [16].Актуальность этих взаимодействий еще полностью не изучена. Среди этих пяти партнеров SARS-CoV домены PDZ белка плотных контактов PALS1/MPP5 и синтенина взаимодействуют с C-концевым PBM белка E. Взаимодействия PBM-PDZ сильно влияют на структуру эпителиальных клеток млекопитающих и могут способствовать резкому ухудшению состояния эпителия легких, наблюдаемому у пациентов, инфицированных SARS-CoV [18]. Поэтому, чтобы лучше понять влияние мотивов PDZ хозяина и вирусных PBM на патогенность SARS-CoV-2, мы провели целевой скрининг для выявления клеточных доменов PDZ, способных взаимодействовать с белками CoV мотивов PBM.

    Рисунок 1: Последовательности белка Е.

    (A) Сравнение последовательностей белка Е вирусов SARS-CoV-2 и SARS-CoV. Геном SARS-CoV-2 очень похож на SARS-CoV. Последние три остатка, образующие последовательность PBM (выделены жирным шрифтом), строго консервативны. Делеция и замена аминокислот рядом с PBM окрашены в красный цвет. Трансмембранная спираль (ТМ) подчеркнута. (B) Последовательности пептидов, используемых в качестве приманки в анализах задержания. Остатки PBM выделены жирным шрифтом. (C) Три класса PBM. X — любая аминокислота (позиция — 1), а φ — гидрофобная аминокислота (позиция 0).

    В этом исследовании мы использовали анализ удержания [19], высокопроизводительный и количественный подход, который предлагает высокую чувствительность для аффинности от низкой до средней (1-100 мкМ), обычно обнаруживаемой для взаимодействий PDZ/PBM. Мы установили список партнеров, содержащих PDZ, потенциально мишенью для белка E SARS-CoV-2 через его PBM. В этой работе были идентифицированы десять PDZ и определена их аффинность к белку E SARS-CoV-2. Большинство из них участвует в динамике клеточных соединений (PARD3, TJP1/ZO-1, LNX2, MLLT4, NHERF1).Чтобы лучше понять потенциальное влияние PDZ-PBM на патогенность, мы также определили PDZ-содержащие белки, распознаваемые белком E вирусов SARS-CoV и MERS-CoV, а также связывающие PDZ вирусы SARS-CoV- 2 3a и N белков, которые также кодируют С-концевую последовательность РВМ. Из этого списка PDZ мы выбрали 20 PDZ-содержащих партнеров SARS-CoV-2 для оценки их влияния на репликацию SARS-CoV-2 в инфицированных клетках и обнаружили, что экспрессия семи из них имеет отношение к эффективности репликации вируса. .

    РЕЗУЛЬТАТЫ

    Белок Е SARS-CoV2 распознает несколько клеточных белков, содержащих PDZ II (рис. 1С). Этот мотив строго консервативен в белке Е SARS-CoV2 (рис. 1А). Для количественной оценки связывающей активности SARS-CoV2 E PBM мы использовали

    in vitro автоматизированный высокопроизводительный хроматографический анализ, называемый задержкой [19,20]. Был синтезирован 12-членный пептид, включающий С-концевую последовательность РВМ белка Е SARS-CoV2, связанную с биотинильной группой (рис.1Б). Этот пептид использовали в качестве приманки для количественной оценки взаимодействия между пептидом PBM белка E SARS-CoV2 и полной библиотекой доменов PDZ человека, экспрессированной в Escherichia coli . Обновленная библиотека PDZ под названием PDZome V.2 охватывает 98 % «PDZome» человека (266 из 272 доменов PDZ, идентифицированных в геноме человека) [20,21]. Каждая PDZ библиотеки определяется именем белка, за которым следует номер PDZ в белке. Подход с удержанием демонстрирует высокую чувствительность обнаружения для пар PDZ/PBM с низкой и средней аффинностью и обеспечивает ранжирование идентифицированных связывающих веществ на основе аффинности, соответствующее профилю специфичности [22].

    Профили специфичности для SARS-CoV, SARS-CoV-2 и MERS-CoV E PBM со средними значениями интенсивности связывания (BI) представлены на рис. 2A с ранжированием на основе аффинности. Интенсивность связывания в стационарном состоянии может быть преобразована в константы диссоциации, как описано ранее [23]. Для этого мы определили константы диссоциации нескольких взаимодействий PBM-PDZ, используя конкурентный анализ поляризации флуоресценции. Анализ удержания выявил несколько значительных взаимодействий для трех вирусов.Используя строгий порог, ранее определенный для значительных обнаруживаемых связывающих веществ в анализах удерживания при BI > 0,2 (константа диссоциации ~ 100 мкМ), десять связывающих PDZ белков Е SARS-CoV-2 показали взаимодействия со значениями сродства в диапазоне от 2,6 мкМ (TJP1_2) до 82. мкМ (MLLT4) (рис. 2, увеличенное изображение, таблица 1). Таким образом, последовательность PBM белка E SARS-CoV-2 обладает способностью связывать in vitro несколько доменов PDZ в диапазоне аффинности 1–100 мкМ, обычно обнаруживаемом для взаимодействий PDZ/PBM. Как показано на резком профиле взаимодействия на рис.2A, SARS-CoV2 E PBM распознает только 4 % доменов PDZ из библиотеки PDZ человека, что отражает специфичность этих взаимодействий.

    Рисунок 2; PDZ, связывающие РВМ с белком Е, по анализу удержания.

    (A) Профили связывания PDZome PBM белка E с помощью анализа удержания SARS-CoV (верхняя панель), SARS-CoV-2 (средняя панель) и MERS-CoV (нижняя панель). Домены PDZ ранжируются по пониженным значениям BI. Увеличенные изображения показывают 7, 10 и 29 PDZ-связывающие белки SARS-CoV, SARS-CoV-2 и MERS-CoV E, соответственно, которые показали значительные значения BI выше 0.2. Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения двух независимых экспериментов. Черные кружки соответствуют значениям сродства (Kd) в мкМ (вторичная ось Y). (B) Диаграмма Венна связывающих PDZ белков E PBM SARS-CoV, SARS-CoV-2 и MERS-CoV.

    Таблица 1; Измеренные значения BI и преобразованные значения Kd (мкМ) доменов PDZ для PBM белка E SARS-CoV (A), SARS-CoV-2 (B) и MERS-CoV (C).

    Сообщаются только значимые значения BI выше 0,2. При проведении нескольких экспериментов с задержкой сообщаются усредненные значения BI и стандартные отклонения.

    Паттерны PDZ-содержащих белков человека, на которые преимущественно нацелены белки E, экспрессируемые вирусами SARS-CoV, SARS-CoV-2 и MERS-CoV

    Два различия в последовательности между белками E SARS-CoV и SARS-CoV2 наблюдаются перед идентичные последовательности PBM (рис. 1B).

    Семь белков, содержащих PDZ (3%), были идентифицированы как связывающие PBM SARS-CoV E с помощью высокопроизводительной задержки (таблица 1). Шесть из них также являются связывающими PBM вирусами SARS-CoV-2 E, ранжированными по уменьшенным значениям сродства на рис.2Б; TJP1-2, PTPN13_4, HTRA1, MLLT4, PARD3_3 LNX2_2. Сродство PBM SARS-CoV и SARS-CoV-2 E к этому набору белков одинаково, что согласуется со строгим сохранением последних пяти C-концевых положений PBM (от p0 до p-4) (рис. 1A). ; Таблица 1). PDZ2_6 распознается только PBM E SARS-CoV, в то время как четыре дополнительных PDZ распознаются только PBM E SARS-CoV-2 (NHERF1_2, MAST2, RADIL, SNX27). Таким образом, различия в восходящей последовательности PBM увеличивают количество связывателей для белка E SARS-CoV-2 с четырьмя дополнительными партнерами-хозяевами.

    Белок E БВРС-КоВ кодирует PBM класса III (рис. 1B и C). По сравнению с паттернами E SARS-CoV/ SARS-CoV-2 профиль взаимодействия PBM E MERS-CoV расширен за счет большего количества партнеров, т.е. 29 (11 %), в том же диапазоне сродства между 5 мкМ и 82 мкМ (таблица 1). Шесть из семи PDZ-содержащих партнеров E PBM SARS-CoV и шесть из десяти PDZ-содержащих партнеров E PBM SARS-CoV-2 также распознаются MERS-CoV E PBM (рис. 2B).

    С-концевые мотивы белков N и 3a SARS-CoV2 также связываются с клеточными белками, содержащими PDZ

    Мы систематически проанализировали последовательности 29 белков SARS-CoV-2 для поиска потенциальных PBM.В соответствии с предыдущей работой по SARS-CoV [24] мы идентифицировали два мотива PBM на С-конце двух SARS-CoV-2, а именно белки E и 3a. Последовательности РВМ белков Е и 3а (рис. 3А), двух виропоринов, относятся к одному и тому же классу РВМ, классу II (рис. 1С). В то время как PBM белка E участвует в вирулентности и репликации SARS-CoV [17], мотив белка 3a не оказывает существенного влияния на рост вируса [24]. Однако было показано, что этот вспомогательный белок 3a может проявлять компенсаторную функцию в отсутствие E при репликации вируса in vitro и in vivo .Эта гомология предполагает, что белки E и 3a могут взаимодействовать с обычными белками хозяина, содержащими PDZ.

    Рисунок 3; Профили связывания PDZome белка N SARS-CoV2 и белка 3a PBM с помощью анализа удержания.

    (A) последовательности пептидов E, N и 3a, используемые в качестве приманок в анализах задержания. (B) домены PDZ ранжированы по уменьшенным значениям BI. Увеличенные изображения показывают 2 и 5 PDZ-связывающие белки N и 3a SARS-CoV-2 соответственно, которые показали значительные значения BI выше 0,2. Черные кружки соответствуют значениям сродства (Kd) в мкМ (вторичная ось Y).

    Мы также идентифицировали потенциальную последовательность PBM на С-конце структурного нуклеокапсидного белка N. Этот мотив класса I нетипичен наличием небольшого гидрофобного остатка, т.е. аланина, в последнем положении (рис. 3А).

    Профили связывания PBM из белков SARS-CoV-2 3a и N представлены на рис. 3B. Пять связующих (2%) показали значительные значения BI выше 0,2: TJP1_2, NHERF4_1, NHERF3_4, RGS3 и PARD3B_1, ранжированные по уменьшенным значениям аффинности. Интересно, что белок E SARS-CoV и SARS-CoV-2 и белок 3a SARS-CoV-2 имеют один и тот же лучший связыватель TJP1_2, и оба также распознают домен PDZ PARD3B.NHERF3 и NHERF4 — это два новых связывателя SARS-CoV-2, в то время как RGS3 также распознается белком E MERS-CoV. Следует отметить, что диапазон аффинности белка 3а к его связывателям ниже, чем у белка Е, от 25 до 80 мкМ. Что касается связывающих N белков PBM, идентифицированы только два домена PDZ (1 %): RHNP2 и GIPC1. Эти белки не были идентифицированы как связывающие белки Е и белок 3а. GIPC1 представляет собой PDZ-содержащий белок, распознаваемый PBM капсидного белка вируса гепатита В, и может вмещать другой атипичный небольшой С-концевой остаток, цистеин [25].

    Влияние истощения клеточных PDZ-содержащих белков на репликацию SARS-CoV2

    Затем мы исследовали биологическую роль PDZ-содержащих партнеров белков SARS-CoV-2 в репликации вируса в соответствии с результатами нашего анализа удержания.

    Мы составили список потенциальных партнеров PDZ, распознаваемых по крайней мере по одному из мотивов PBM, кодируемых белками E, 3a или N SARS-CoV-2 (таблица 2). Мы выбрали 16 партнеров PDZ, идентифицированных с интенсивностью связывания выше 0.2 (рис. 2B и 3B), и добавили 4 дополнительных партнера PDZ со значениями BI от 0,16 до 0,20; MPP5/PALS1, PDZD2 и DLG3 распознаются белком E SARS-CoV-2 и FRMPD4, связывающим белки E и 3A SARS-CoV-2.

    Таблица 2; Клеточные белки, содержащие PDZ, распознаются по крайней мере одним белком SARS-CoV-2 в анализах задержания.

    Список из 20 PDZ-партнеров белков SARS-CoV-2, отобранных для нокдауна с помощью трансфекции миРНК в клетках легких человека A549. (+) указаны партнеры PDZ, идентифицированные с помощью анализа со значениями аффинности связывания выше 0.2; (+/-) представляют собой связующие PDZ со значениями BI в диапазоне от 0,16 (105 мкМ) до 0,20 (80 мкМ).

    Двадцать белков, содержащих PDZ человека, были нацелены на нокдаун путем трансфекции миРНК в клетках легкого человека A549. Эта клеточная линия стабильно экспрессирует рецептор ACE2 SARS-CoV-2 [26]. В нашем подходе к нокдауну экспрессии генов использовались пулы миРНК, содержащие смесь четырех отдельных миРНК), которые разработаны и модифицированы для большей специфичности, обеспечивая гарантированное замалчивание генов человеческих мишеней.Мы проверили эти пулы миРНК ранее в скрининге, проведенном в клетках человека A549, сверхэкспрессирующих ACE-2 (таблица S1). Наш подход подтвердил, что нокдаун ряда различных генов, включая рецептор ACE-2, и другие неожиданные гены, такие как BZW2 или BRD4, снижает репликацию SARS-CoV-2 в этих клетках [3]. Влияние нокдауна партнера PDZ на репликацию вируса оценивали в трех независимых экспериментах и ​​сравнивали с репликацией вируса в контрольных клетках, трансфицированных миРНК (двусторонний дисперсионный анализ с критерием Даннета).Как и ожидалось, нокдаун рецептора ACE2 SARS-CoV-2 привел к значительному снижению репликации вируса (рис. 4). Репликация вируса также была значительно снижена в клетках с нокдауном PARD3 и RSG3, что указывает на провирусную роль этих белков человека. PARD3 обнаруживается в наших анализах удержания в качестве PDZ-партнера белка E SARS-CoV, SARS-CoV-2 и MERS-CoV, в то время как RGS3 распознается белком SARS-CoV2 3a. Для сравнения, нокдаун MLLT4, PARD3B, MAST2, RHPN2 и HTRA вызывал повышенную репликацию вируса.MLLT4, MAST2 и HTRA1 взаимодействуют с белком E SARS-CoV-2, PARD3B с белком 3a SARS-CoV-2, и, наконец, RHPN2 связывается с белком N SARS-CoV-2.

    Рисунок 4; Влияние нокдауна белков, содержащих PDZ человека, на репликацию SARS-CoV-2.

    Указанные гены были нокдаунированы трансфекцией миРНК в клетках легкого человека A549-ACE2. Нокдаун ACE2 использовали в качестве положительного контроля. Вирусную нагрузку в нокаутированных клетках оценивали в трех независимых экспериментах через 72 часа после инфицирования и выражали в эквивалентах бляшкообразующих единиц (БОЕ)/мл супернатанта.Вирусную нагрузку в каждом состоянии сравнивали с таковой в контрольных клетках, трансфицированных миРНК (двусторонний ANOVA с критерием Даннета для множественных сравнений *** p ≤0,001; ** p =0,00611; * p =0,02672 ).

    В целом наши результаты показали, что экспрессия этих семи белков имеет отношение к репликации вируса.

    ОБСУЖДЕНИЕ

    Только несколько партнеров белка E SARS-CoV-2 были идентифицированы с помощью обширных высокопроизводительных подходов, таких как протеомика.Например, среди структурных белков SARS-CoV-2 только 6 связывателей белка E обнаружены, как проверено в Gordon и al . исследовании, при этом идентифицировано 30 партнеров для М-белка и 15 связывателей для N-белка [3]. Среди них в этом исследовании не было идентифицировано ни одного PDZ-содержащего белка. Здесь мы сосредоточились на специфических взаимодействиях с участием коротких С-концевых мотивов белков SARS-CoV-2, доменов PBM и PDZ партнеров человека. В основном мы использовали высокопроизводительный скрининг удержания для идентификации PDZ-партнеров белков E, 3a и N-хозяина и для количественной оценки их сродства и специфичности PDZ-PBM [19].Этот хроматографический анализ в растворе полностью подходит для точного ранжирования взаимодействий с низким сродством в субмиллимолярном диапазоне, которые могут не обнаруживаться другими высокопроизводительными методами.

    Консервация последовательности PBM в белке E коронавируса

    Мотив PBM на С-конце белка E экспрессируется только короновирусами родов a и ß и отсутствует у рода g. Последние 4 остатка белка Е строго консервативны в вирусах SARS-CoV и SARS-CoV-2. Недавнее исследование показало, что среди 3617 доступных полных последовательностей генома SARS-CoV-2 в базе данных NCBI сообщалось только о двух вариантах (DFLV и YLLV) в мотиве DLLV PBM белка E [27].

    Оба белка E SARS-CoV-2 и MERS-CoV содержат предполагаемые последовательности PBM на их С-конце, но их природа сильно различается: PBM класса II для рода a и PBM класса III для рода ß . Наша работа показывает, что, несмотря на отсутствие консервативности между последовательностью PBM SARS-CoV/CoV-2 и белком E MERS-CoV, эти два мотива взаимодействуют с общим набором партнеров-хозяев; действительно, среди десяти партнеров-хозяев, которые мы определили для SARS-CoV-2, шесть также являются связующими для MERS-CoV.

    Взаимодействия белок-белок вируса-хозяина

    Сравнение партнеров-хозяев CoV и CoV-2

    Ранжирование на основе аффинности идентифицированных связывателей белка Е позволило получить профиль специфичности. Для сравнения, PBM класса I белка NS5 вируса Западного Нила и капсидного белка вируса гепатита B взаимодействуют с 29 и 28 связывателями PDZ [25, 28] соответственно, в то время как около 50 белков PDZ связываются с PBM класса I вируса E6. онкопротеин вируса папилломы человека HPV16 [19].Напротив, РВМ класса II обычно демонстрируют более низкое сродство к своей мишени и, следовательно, наименьшее количество связующих по сравнению с РВМ класса I. Гидрофобный характер последовательностей PBM класса II может объяснить низкое сродство и четкие профили связывания белка E PBM SARS-CoV (6 связующих) и SARS-CoV-2 (10 связующих) с уменьшенным энтальпийным вкладом в связывание по сравнению с более гидрофильные последовательности класса I. Интересно, что PBM белка E SARS-CoV-2 может вмещать различные классы доменов PDZ, как показано в таблице S2.В случае РВМ класса III белка Е для БВРС-КоВ большое количество мишеней (29) можно в основном объяснить наличием остатка триптофана в положении -1, остатка, который, как известно, вносит значительный вклад в аффинность связывания [29], потенциально за счет специфичности. Ранее мы предположили, что большое количество клеточных белков, на которые нацелен ВЗН, идентифицированных с помощью анализа Hold-up, может быть связано с широким репертуаром флавивирусов-хозяев, реплицирующихся в очень разных клетках и видах, необходимых для его сложного зоонозного цикла передачи.Напротив, вирусы SARS-CoV инфицируют очень специализированные клетки, такие как клетки бронхиального эпителия, пневмоциты и клетки верхних дыхательных путей человека [30]. Это наблюдение может, по крайней мере, частично объяснить небольшое количество белков-хозяев, на которые SARS-CoV-2 нацеливается во время инфекции.

    Шесть из семи PDZ-партнеров белка E SARS-CoV также являются связывающими белками E белка SARS-CoV-2 в соответствии со строгим сохранением их PBM. Однако различия в последовательности выше PBM увеличивают количество связывателей белка E SARS-CoV-2 еще с четырьмя партнерами-хозяевами (рис.1А). Наши результаты показывают, что разница в последовательностях вышележащих PBM SARS-CoV/SARS-CoV-2 ответственна за различные профили связывания с PDZome человека. Несколько исследований показывают, что остатки до одиннадцатого положения вверх по течению (p-11) также могут быть вовлечены в связывание PDZ путем модулирования аффинности [29,31]. Таким образом, мы можем предположить, что замена Arg (p-6 в последовательности SARS-CoV) на Glu (p-7 в последовательности SARS-CoV-2) может повлиять на потенциальное электростатическое взаимодействие белка Е с петлей ß2-ß3 некоторые домены PDZ.Интересно, что сообщалось, что замена Glu в положении -5 на Arg во внутреннем ректификаторе K(+) канала белка GIRK3 нарушает его взаимодействие с PDZ-доменом SNX27 [32]. Здесь мы также наблюдали, что SNX27 связывается с белком E SARS-CoV-2, экспонируя Arg в p-7, в то время как белок E SARS-CoV, кодирующий Glu в p-6, этого не делает. Этот пример иллюстрирует точную настройку профилей аффинности/специфичности с помощью четырех остатков PBM и вышестоящей последовательности. Следовательно, замена заряженных остатков между PBM SARS-CoV и SARS-CoV-2 может изменить селективную ассоциацию белков PDZ хозяина с вирусным белком.Четыре белка PDZ хозяина, SNX27, RADIL, NHERF1 и MAST2, распознаваемые SARS-CoV-2, а не SARS-CoV, могут играть роль в различиях, наблюдаемых между двумя инфекциями. Роль этих белков PDZ в вирусном патогенезе еще предстоит изучить.

    Функции белков-хозяев-партнеров белка E SARS

    Среди пяти белков-хозяев, о которых уже сообщалось в качестве партнеров белка E (Schoeman et al., 2019), синтенин/SCDP и MPP5/PALS1 кодируют PBM, потенциально участвующие в связывании PDZ.Мы не обнаружили взаимодействия между синтениновым доменом PDZ и Е-белком SARS-CoV-2. С помощью анализа удержания мы измерили слабое взаимодействие между доменом PDZ MPP5/PALS1 и E PBM SARS-CoV-2 (Kd 102 мкМ), в то время как мы не отслеживали взаимодействие между доменом PDZ MPP5/PALS1 и E PBM SARS-CoV. Используя равновесное титрование связывания in vitro с помощью резонансной передачи энергии Фёрстера (FRET), Тото и его сотрудники [33] также рассчитали более высокую аффинность SARS-CoV-2 к MPP5/PALS1, что иллюстрирует потенциальную роль восходящих замен, наблюдаемых в последовательность С-концевого Е-белка SARS-CoV-2 по сравнению с SARS-CoV.Teoh и соавторы [18] предположили, что это взаимодействие между белком E SARS-CoV и MPP5/PALS1 изменяет плотные соединения в легких, при этом MPP5/PALS1 является ключевым компонентом комплекса Крамбса, который контролирует апикально-базальную полярность и плотные соединения. формирование. Мы не можем исключить, что остальные белки MPP5 и E необходимы для стабилизации их комплекса, а также для синтенина, который, как сообщается, связывает белок E с помощью стратегий с использованием полноразмерных белков (двухгибридные дрожжи, реципрокная коиммунопреципитация и анализы конфокальной микроскопии). ).

    Примечательно, что мы точно определили, что большинство связывающих белков участвуют в клеточных соединениях и полярности, клеточном транспорте и передаче сигналов. Действительно, наши результаты показали, что SARS-CoV-2 нацелен на несколько соединений апикального комплекса и плотных/адгезивных соединений. Следовательно, мы ожидаем, что белки SARS-CoV-2 E, 3a и N могут способствовать глобальному влиянию на клеточные соединения и клеточную полярность. Мы определили ZO-1 как лучшее связующее для белков E и 3a. Белки ZO обеспечивают сеть каркасных белков, которые связывают трансмембранные белки плотных соединений, включающие Claudins, с актиновым цитоскелетом [34].Три ZO-паралогических белка, ZO-1, ZO-2 и ZO-3, кодируют три домена PDZ в своей N-концевой области. В нашем анализе in vitro вторая PDZ ZO-1/TJP1 демонстрирует наивысшую аффинность к белкам E и 3a SARS-CoV2 в микромолярном диапазоне. Этот домен ранее был описан как сайт связывания ZO-1 с коннексином 43 [35], участвующим в организации щелевого соединения, а также в гетероассоциации ZO-2 и ZO-3. Димеризация ZO-1 происходит посредством взаимодействия между доменами ZO1-PDZ2, а димеризация ZO-1-PDZ2 с заменой регулирует связывание коннексина-43 [36].Интересно, что белки ZO также взаимодействуют с Afadin/MLLT4, в то время как последовательность PBM ZO-2 связывается с доменом PDZ SNX27, чтобы регулировать доставку ZO-2 к плотному соединению [37,38]. PARD3 также участвует в формировании адгезивов и плотных контактов. Здесь мы показали, что MLLT4, SNX27, PARD3 и MPP5/PALS1 в меньшей степени также являются мишенями для SARS-CoV-2 E PBM. Взаимодействуя по крайней мере с пятью белками, непосредственно участвующими в организации комплексов плотных контактов, мы ожидаем глобального нарушения эпителиально-эндотелиальных барьеров SARS-CoV-2 во время инфекции.В этом направлении репликация SARS-CoV-2 вызывает временное снижение функции клеточного барьера и нарушение плотных контактов [39], а продуктивная инфекция SARS-CoV-2 локально изменяет распределение ZO-1, который ассоциируется с плотными контактами. Характерный образец окрашивания ZO-1 на границах клеток оказался нарушенным в областях с вирусной экспрессией, что свидетельствует о возможном нарушении целостности эпителиального барьера.

    Нацеливание на белки-хозяева из комплексов полярности и соединений может оказывать влияние на морфологию эпителия/эндотелия, а также на иммунный ответ и клеточный гомеостаз [40].Помимо своей структурной роли во многих тканях и органах, они также могут регулировать сигнальные механизмы. Плотные контакты связаны со многими заболеваниями человека. Следовательно, хронические воспалительные заболевания и рак связаны с дисфункцией плотных соединений. MPP5/PALS1 комплекса Крамбса экспрессируется в Т-лимфоцитах и ​​необходим для активации, опосредованной Т-клеточным рецептором (TCR) [41]. ZO-1 и ZO-2 также экспрессируются в Т-лимфоцитах и ​​перемещаются в иммунный синапс после стимуляции TCR.SNX27 регулирует транспортировку и рециркуляцию Т-лимфоцитов и контролирует подвижность ZO-2 в иммунных синапсах посредством PDZ-зависимого взаимодействия [42]. LNX1/2 участвует в передаче сигналов с участием в убиквитинировании с последующей протеасомной деградацией. Домен PDZ3 PARD3 связывается с фактором транскрипции YAP (Yes-associated protein) [43], регулируя активацию пути Hippo, сигнального пути, модулирующего пролиферацию клеток и гибель клеток. Белок YAP может быть обнаружен ассоциированным с адгезивами и плотными соединениями, а несколько регуляторов пути Hippo являются компонентами адгезивов и плотных контактов [44].Наконец, NHERF1 регулирует передачу сигналов Wnt/b-catenin, путь, который регулирует рост и пролиферацию клеток. Было показано, что NHERF1 подвергается деградации с помощью Е6 из ВПЧ [45]. RHPN2 (путь Rho; [46]), MAST2 (путь антивыживания, передача сигналов PTEN/Akt; [12]), RGS3 (передача сигналов G-белка; [47]), PTPN13 (супрессор опухоли, передача сигналов Akt; [48]) и HTRA1 (Signaling path TGF-ß; [49]) также играют роль в сигнальных путях. В нашем анализе задержки было обнаружено, что все эти белки в значительной степени взаимодействуют с белками SARS-CoV-2.Семь из 14 хозяев-мишеней белков E, 3a и N SARS-CoV2 значительно повлияли на репликацию вируса. Мы показали, что нокдаун PDZ-содержащих белков PARD3 и RSG3 приводит к снижению репликации SARS-CoV-2 в клетках, в то время как подавление MLLT4, PARD3B, MAST2, RHPN2 и HTRA1 увеличивает репликацию вируса. Эти белки участвуют в регуляции клеточных соединений и полярности, а также в клеточной передаче сигналов. Однако мы не можем сделать вывод о зависимости этого результата от PDZ/PBM, и необходимы дальнейшие исследования клеток для расшифровки функциональной роли этих белков в вирусном цикле SARS-CoV-2.

    Белки PDZ, распознаваемые белком E SARS-CoV-2, также являются мишенями-хозяевами для других вирусов

    Многие исследования предоставляют структурные и биологические доказательства того, что вирусные белки действуют как конкуренты, наделенные специфичностью и аффинностью в важном клеточном процессе, имитируя PBM сотовые партнеры. Нарушение критических эндогенных белок-белковых взаимодействий вирусным белком резко изменяет внутриклеточный транспорт белка и каталитическую активность клеточных белков, которые контролируют клеточный гомеостаз.Важно отметить, что большинство выбранных нами белков-хозяев, содержащих PDZ, ранее были описаны как белки-хозяева, на которые нацелены вирусы. Известно, что плотные контакты являются мишенью для множества патогенных вирусов [50,51]. PARD3 и TJP1 являются мишенями белков флавивирусов (ВЗН, ВКЭ и ДВ) [28, 52–54]. Другие клеточные белки PDZ также были идентифицированы как мишени для других вирусов, включая DLG1 для вируса гепатита С и вируса гриппа [55,56]; NHERF1, HTRA1, PARD3, SNX27 для вируса папилломы человека [45,57–59].

    Здесь мы показали, что три вирусных PBM-содержащих белка, экспрессируемых SARS-CoV-2, нацелены на несколько клеточных белков, участвующих в поддержании и регуляции плотных контактов и иммунного ответа. Захватывая соединительные белки и сигнальные механизмы, вирусы обеспечивают свое размножение посредством манипулирования клеточным гомеостазом, иммунной системой и тканевыми барьерами. Нарушение клеточной приспособленности способствует их репликации и распространению. Многие PDZ-содержащие белки участвуют в межклеточных соединениях, клеточной полярности, рециркуляции или транспортировке.Имитация коротких линейных мотивов PBM для нацеливания на белок PDZ и подрыв функционала хозяина y является высокой адаптационной способностью и значительным эволюционным преимуществом многих вирусов [40]. Ранее мы показали, что PBM из гликопротеина, кодируемого вирусом бешенства, конкурирует с PTEN за связывание с киназой против выживания MAST2 и резко влияет на сигнальный путь PTEN/Akt. Следовательно, взаимодействие вирусного гликопротеина/MAST2 способствует выживанию инфицированных нейронов, обеспечивая размножение вируса.Как уже наблюдалось для других вирусов, потенциальное плейотропное нарушение клеточных функций может быть вызвано SARS-CoV-2 во время инфекции, включая выживание/гибель клеток (MAST2, PARD3, NHERF1), иммунный ответ (MPP5/PALS1, синтенин) и клеточную организацию. (ЗО-1, МЛЛТ4).

    Материалы и методы

    Синтез пептидов

    Пептиды синтезировали в твердой фазе с использованием стратегии Fmoc (Proteogenix), включающей биотинильную группу, спейсер (PEG)3 или 6-аминогексановую кислоту (Ahx) и С-концевую последовательность PBM. белков E, 3A и N (длиной 12 остатков).Пептиды ресуспендировали в воде или в смеси ДМСО и буфера и использовали для анализов удержания и конкурентной поляризации флуоресценции.

    Анализы Holdup

    Мы использовали обновленную версию нашей оригинальной библиотеки PDZome [19], которая содержит 266 растворимых PDZ [20]. Эта библиотека PDZome v2 была подготовлена, как описано ранее [20].

    Анализ удержания был проведен с биотинилированными вирусными PBM против полной библиотеки PDZ человека в двух независимых экспериментах [19,20]. Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения двух экспериментов.Значения аффинности (рис. 1, таблица 1) рассчитывали на основе интенсивности связывания в соответствии с методом, опубликованным Gogl et al. [23]. Концентрации иммобилизованного пептида рассчитывали, используя измеренные константы диссоциации из анализов конкурентной флуоресцентной поляризации (см. ниже). Мы обнаружили, что все определенные пары BI-Kd дают среднюю концентрацию пептида ~ 20 мкМ, концентрацию, которая согласуется с другими пептидами в том же методе [22, 23, 60]. Минимальное пороговое значение интенсивности связывания (BI) равно 0.2, чтобы определить значимое взаимодействие, примерно соответствующее константе диссоциации 100 мкМ, как сообщалось ранее [19].

    Конкурентный анализ поляризации флуоресценции

    Конкурентный анализ поляризации флуоресценции и оценка данных были выполнены, как описано Саймоном и сотрудниками [61]. Были использованы четыре различных флуоресцентных пептида: f16E6 (флуоресцеин-RTRRETQL), fRSK1 (флуоресцеин-KLPSTTL), fpRSK1 (флуоресцеин-KLPpSTTL) и MERS-CoV. Пептид MERS-CoV был помечен субстехиометрическим FITC (Sigma-Aldrich, St.Louis, Миссури) в основном буфере HEPES (pH 8,2) и реакцию останавливали 100 мМ TRIS. Пептид был заменен буфером для удаления флуоресцентных примесей. Поляризацию флуоресценции измеряли с помощью устройства для считывания микропланшетов PHERAstar (BMG Labtech, Оффенбург, Германия) с использованием полосовых фильтров 485 ± 20 нм и 528 ± 20 нм (для возбуждения и испускания соответственно). В прямых измерениях FP была приготовлена ​​серия разведений белков MBP-PDZ, очищенных сродством к Ni и амилозе, в 20 мМ HEPES pH 7.5, который содержал 150 мМ NaCl, 0,5 мМ TCEP, 0,01% Tween 20 и 50 нМ флуоресцентно меченого пептида. Всего измеряли поляризацию зонда при 8 различных концентрациях белка. В конкурентных измерениях FP тот же самый буфер был дополнен белком для достижения комплексообразования 60-80%, исходя из прямого титрования. Затем из этой смеси создавали серию разведений конкурента (т.е. исследуемых пептидов) и проводили измерения так же, как и в прямом эксперименте.Анализ экспериментов ФП проводился с помощью ProFit.

    Клетки

    Клетки A549, стабильно экспрессирующие ACE2 (A549-ACE2, любезно предоставленные доктором Оливье Шварцем), размножали при 37°C, 5% CO2 в DMEM с L-глютамином (Gibco) с добавлением 10% FBS, пенициллина -стрептомицин и 20 мкг/мл бластицидина S.

    Вирус

    Используемый штамм SARS-CoV-2 (штамм BetaCoV/France/IDF0372/2020) является любезным подарком Национального справочного центра респираторных вирусов Института Пастера в Париже. , изначально поставляемый через Европейский вирусный архив, выходит на глобальную платформу.Его размножали однократно в клетках Vero-E6.

    siRNA

    трансфекции

    Была приобретена библиотека OnTargetPlus siRNA SMARTpool (Horizon Discovery), нацеленная на 20 белков, содержащих PDZ человека (таблица S3). Эта библиотека была выстроена в 96-луночном формате и также включала нецелевые миРНК и пулы миРНК, нацеленные на ACE2. Библиотеку siRNA трансфицировали в клетки A549-ACE2, высеянные в формат 384-луночных планшетов (6250 клеток на лунку), с использованием реагента Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher).

    Вкратце, 4 пмоль каждого пула миРНК смешивали с 0,1 мкл реагента для трансфекции RNAiMAX и OptiMEM (Thermo Fisher) в общем объеме 10 мкл. После 5-минутного периода инкубации к клеткам добавляли смесь для трансфекции. Через 48 часов после трансфекции клетки либо подвергали заражению SARS-CoV-2, либо инкубировали в течение 72 часов для оценки жизнеспособности клеток с помощью люминесцентного анализа жизнеспособности CellTiter-Glo в соответствии с инструкциями производителя (Promega). Люминесценцию измеряли с помощью планшетного ридера Tecan Infinity 2000 и рассчитывали процент жизнеспособности относительно необработанных клеток (100% жизнеспособность) и клеток, лизированных 20% этанолом или 4% формалином (0% жизнеспособность), включенных в каждый эксперимент.

    Вирусные инфекции

    В случае инфекций среду для культивирования клеток заменяли вирусным инокулятом (MOI 0,1 БОЕ/клетку) и инкубировали в течение одного часа при 37°C, 5% CO2. После одного часа адсорбции инокулят удаляли, заменяли свежей средой и клетки инкубировали при 37°C, 5% CO2. Через 72 ч после инфицирования супернатант клеточной культуры собирали и вирусную нагрузку оценивали с помощью RT-qPCR. Вкратце, супернатант клеточной культуры собирали, инактивировали нагреванием при 95°C в течение 5 минут и использовали для анализа RT-qPCR.Специфические праймеры для SARS-CoV-2, нацеленные на область гена N: 5′-TAATCAGACAAGGAACTGATTA-3′ (прямой) и 5′-CGAAGGTGTGACTTCCATG-3′ (обратный) использовали с универсальным набором Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit (Новая Англия). Biolabs) в термоциклере Applied Biosystems QuantStudio 6 при следующих условиях циклирования: 55°C в течение 10 минут, 95°C в течение 1 минуты и 40 циклов 95°C в течение 10 секунд, а затем 60°C в течение 1 минуты. Количество вирусных геномов выражается в виде эквивалентов БОЕ/мл и рассчитывается путем построения стандартной кривой с использованием РНК, полученной из вирусного штамма с известным вирусным титром.Влияние нокдаунов на репликацию вируса сравнивали с контрольными клетками, трансфицированными миРНК, в трех независимых экспериментах с тестом множественных сравнений Даннета, основанным на двухфакторном ANOVA.

    Благодарности

    Эта работа была поддержана кампанией по сбору средств URGENCE COVID-19 Института Пастера, программой ANR Recherche Action Covid19–FRM PDZCov2 и Французской инфраструктурой комплексной структурной биологии (FRISBI) ANR-10-INSB-05- 01 для АФМБ. GG является получателем программы Post-doctorants en France стипендии Fondation ARC.

    Авторы благодарят Жиля Траве за полезное обсуждение и корректуру рукописи.

    Неожиданное связывание plcβ, опосредованное INAD PDZ, в фоторецепторах дрозофилы

    Основные версии:

    1) Как отмечают авторы, родство между INAD PDZ45 и NORPA CC-PBM является одним из самых тесных среди всех известных взаимодействий PDZ/мишень. Предполагает ли структура возможные причины высокого сродства этого взаимодействия?

    Сложная структура INAD PDZ45/NORPA CC-PBM действительно обеспечивает молекулярную основу для высокоаффинного взаимодействия между двумя белками, как показано на рисунке 2.В дополнение к каноническому взаимодействию PDZ/мишень (т.е. только с несколькими крайними C-концевыми хвостовыми мотивами связывания PDZ, задействующими домен PDZ; сайт 1 на рис. 2D,E), комплекс INAD PDZ45/NORPA CC-PBM содержит два дополнительных сайта связывания (сайты 2 и 3 на рис. 2D,F,G). Эти два дополнительных сайта значительно усиливали связывание (от K d 39 мМ с сайтом 1 до 0,016 мМ с тремя сайтами вместе; рис. 1D). Структура комплекса INAD PDZ45/NORPA CC-PBM также показала, что для связывания необходима структура высокого порядка тандема PDZ45 и спиральной катушки NORPA (рис. 2), что указывает на то, что взаимодействия, обеспечиваемые сайтами 2 и 3, не только повышают аффинность, но также повышают специфичность связывания INAD/NORPA.

    2) Интерфейс взаимодействия между доменами INAD PDZ4 и PDX5 в комплексе INAD/NORPA был описан в предыдущей публикации (Liu et al.). Изменяется ли вообще этот интерфейс, когда INAD привязан к NORPA? Было бы интересно (но необязательно) проверить влияние мутаций этого интерфейса на связывание с NORPA.

    В структуре INAD PDZ45 в комплексе с пептидом NG2 (Liu et al., 2011) контакт между PDZ4 и PDZ5 очень обширен, включает βB, βC и петлю αA/βD, петлю βE/αB из ПДЗ4; также βB’, петля βB’/βC’, βC’ и βD’ из PDZ5.С-концевой хвост PDZ5 загибается назад и соединяется с бороздкой на поверхности PDZ4 и «скрепляет» два домена PDZ вместе (представлено как Figure 5D в Liu et al. (2011)). Мы сравнили структуры INAD PDZ45 в комплексе с пептидом NG2 и в комплексе с NORPA CC-PBM на рисунке 2C нашей рукописи. Интерфейс упаковки INAD PDZ4 и PDZ5 в двух комплексах по существу одинаков (этот момент был добавлен в исправленной рукописи). Основываясь на сложной структуре, мы считаем, что связывание PDZ45 важно для высокоаффинного связывания с NORPA CC-PBM.Чтобы проверить эту гипотезу, мы создали мутант PDZ45 с Thr669, остатком, необходимым для междоменной стабильности, замененным Glu (T669E-PDZ45). Ранее было показано, что мутант T669E нарушает образование супрамодуля PDZ45 (Liu et al., 2011). Пулдаун-анализ показал, что мутант T669E-PDZ45 имеет гораздо более слабое связывание с NORPA CC-PBM (изображение ответа автора 1), что указывает на то, что образование супрамодуля PDZ45 важно для связывания с NORPA. Мы включили эти данные в исправленную рукопись как рисунок 2 — дополнение к рисунку 5D.

    Pull-down анализ, показывающий, что мутант T669E INAD PDZ45 нарушает его связывание с NORPA CC-PBM.

    В этом анализе GFP-слитый T669E-INAD PDZ45 или WT INAD PDZ45 был экспрессирован в клетках HEK293T и подавлен очищенным His-StrepII-меченым NORPA CC-PBM, как подробно описано в разделе «Материалы и методы».

    https://дои.org/10.7554/eLife.41848.021

    3) Имеет ли интерфейс между PDZ4 и PDZ5 какое-либо, хотя бы отдаленное, сходство с интерфейсом между PDZ8 и PDZ9 в интерфейсе INADL/PLCβ4?

    Спасибо за вопрос. Чтобы сравнить интерфейс упаковки между доменами PDZ между INAD PDZ45 и INADL PDZ89, мы выровняли структуры INAD PDZ45 и INADL PDZ89 из двух комплексов, как показано на изображении ответа автора 2. Мы обнаружили несколько сходств двух интерфейсов связывания PDZ: (i ) Вторичные структурные элементы, участвующие в упаковке доменов между PDZ для двух тандемов PDZ, аналогичны (изображение ответа автора 2A–C, с ключевыми остатками, участвующими в междоменной связи, выделенными синими точками на изображении ответа автора 2D). .(ii) С-концевое удлинение хвоста обоих тандемов PDZ участвует в междоменной связи. В INAD PDZ45 С-концевое удлинение PDZ5 связывается с поверхностью PDZ4 и стабилизирует связывание PDZ45. Хотя мы не наблюдали четкой электронной плотности С-концевого удлинения PDZ9 в структуре комплекса INADL/PLCβ4, биохимический анализ показал, что удаление С-концевого удлинения PDZ9 ослабляло комплексное взаимодействие примерно в 5 раз (∆CT на рис. 5I). ), предполагая, что это удлинение С-конца также участвует в связывании PDZ89.Мы добавили вышеуказанные пункты в исправленную рукопись.

    Сравнение упаковки доменов между PDZ тандемов INAD PDZ45 и INADL PDZ89 в двух сложных структурах.

    ( A ) Наложение INAD PDZ45 (желтый) и INADL PDZ89 (зеленый). ( B ) Комбинированное изображение палочки на ленте, показывающее интерфейс упаковки доменов INAD PDZ45.( C ) Комбинированное изображение палочки на ленте, показывающее интерфейс упаковки доменов INADL PDZ89. ( D ) Множественное выравнивание последовательностей INAD PDZ45 и INADL PDZ89 от Drosophila до человека с помощью ClusterW и ESpript (espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/). Ключевые остатки, участвующие в связывании домена PDZ, выделены синими точками. Ключевые остатки доменов PDZ, участвующих в интерфейсе взаимодействия NORPA/PLCβ4, выделены черными точками.

    https://дои.org/10.7554/eLife.41848.022

    4) Авторы обнаружили, что снижение pH буфера с 7,8 до 5,8 резко ослабило связывание между INAD и NORPA примерно в 6700 раз (рис. 3E). Можно ли это объяснить структурой комплекса?

    Этот момент был рассмотрен в нашей предыдущей работе (Liu et al., 2011). Вкратце, мы продемонстрировали, что пара водородных связей между His547 в PDZ4 и Thr669 в отростке хвоста PDZ5 жизненно важна для связывания PDZ45 и снижения pH (феномен, который может происходить, когда фоторецепторы активируются светом (Huang et al., 2010; Liu et al., 2011) может отделять супрамодуль PDZ45 за счет протонирования боковой цепи His547. В этом исследовании мы предсказали, что если этот активируемый светом/pH-опосредованный механизм развязки между PDZ45 действительно работает, мы должны быть в состоянии обнаружить индуцированное pH нарушение связывания между PDZ45 и NORPA. Наши биохимические данные действительно подтверждают этот механизм. Недавно добавленные данные, показывающие ослабление связывания между T669E-PDZ45 и NORPA CC-PBM на изображении ответа автора 1, также подтверждают этот механизм.

    5) Супрамодульное взаимодействие между тандемом CC-PBM и PDZ подтверждается достоверными данными и представляет собой новый функциональный механизм каркасных белков PDZ. Потенциальной проблемой является участие этого взаимодействия в передаче сигналов ipRGC. Когда PBM NORPA удаляется, как активация, так и деактивация фотореакции мух становятся медленными при любой интенсивности света (Shieh et al., 1997). В случае PLCβ4, напротив, делеция PBM не вызывала изменения фотоответа ipRGC при высокой интенсивности, но несколько повышала скорость дезактивации ответов на тусклый свет.Этот эффект, если он был реальным, указывал на роль, противоположную известной цели сборки сигнальных комплексов GPCR, т. е. на ускорение передачи сигналов. Действительно ли INADL требуется для фотоответа ipRGC? Пытались ли авторы подавить экспрессию INADL или, по крайней мере, показать, что она колокализуется с PLCβ4 в ipRGC?

    Мы ценим комментарии рецензента. Мы полностью согласны с опасениями рецензентов, что текущие доказательства недостаточно убедительны, чтобы поддерживать прямое участие INADL в передаче сигналов ipRGC.Учитывая, что в будущем потребуется значительная работа, чтобы доказать или опровергнуть вышеуказанный пункт. Мы считаем, что для научной строгости лучше удалить довольно предварительные данные о мутанте PLCβ4 в зрительной системе мышей и связанное с этим обсуждение из текущей рукописи. Вместо этого мы заявили, что потребуются будущие исследования, чтобы проверить, может ли взаимодействие INADL / PLCβ4, выявленное в этом исследовании, быть функциональным в передаче сигналов ipRGC или PLCβ4 в других тканях. Соответственно, мы изменили название нашей рукописи на «Неожиданное PDZ-тандем-опосредованное связывание PLCβ, критическое для передачи фотосигнала у Drosophila » и изменили реферат и текст во всей рукописи.

    6) INADL может образовывать сигнальный комплекс с PLCβ4 в некоторых типах клеток, но появление в ipRGC совершенно неубедительно на основании показанных электрофизиологических результатов. Пожалуйста, рассмотрите возможность удаления этой части заключения. Если авторы хотели бы усилить рукопись, они могли бы получить in vivo доказательства супрамодульного взаимодействия с помощью анализов на мухах. Например, авт. могут найти точечную мутацию в PDZ4 из INAD, которая нарушает его взаимодействие с NORPA, и продемонстрировать на трансгенных мухах, что эта мутация фенокопирует PBM-отсутствующий NORPA.

    См. наш ответ на пункт выше.

    7) Новые структуры обеспечивают понимание взаимодействия доменов PDZ и связывающих их белков. Однако функция этого взаимодействия in vivo отсутствует, и вывод о том, что взаимодействия PLCβs/PDZ сохраняются в передаче сигналов ipRGC, не полностью подтверждается. Ранее было показано, что PDZ1 связывается с С-концом NORPA, в то время как PDZ5 связывается с внутренней областью (включая С-концевой спирально-спиральный домен) (van Huizen et al., 1998), кроме того, была определена кристаллическая структура PDZ1 и С-концевого пептида (Kimple et al., 2001). Авторы обнаружили, что PDZ45 прочно связывается с С-концевыми областями. Пожалуйста, комментируйте и обсуждайте.

    Благодарим рецензента за комментарии. Действительно, в ранней литературе были сообщения об INAD PDZ1 и NORPA. В 2001 г. Кимпл и соавт. определили кристаллическую структуру INAD PDZ1 в комплексе с NORPA C-концевым пептидом из пяти последних аминокислот (последовательность: TEFCA). Хотя в этих статьях эксперименты проводились тщательно, в этих исследованиях была обнаружена непредвиденная ошибка в последовательности NORPA.Ранняя версия последовательности NORPA, хранящаяся в базе данных, содержала ошибку. Последним аминокислотным остатком должен быть Tyr вместо Cys (т. е. должен быть EEEAYKTQGKTEFYA вместо EEEAYKTQGKTEFCA; позже эта ошибка была исправлена ​​в базе данных NCBI и uniprot). Остаток Tyr в положении -1 NORPA PBM очень важен для взаимодействия INAD PDZ45, как показано на рисунке 2F, и замена Tyr на Ala в значительной степени ослабила это взаимодействие (рисунок 2H). Ошибка последовательности NORPA также объясняет искусственную дисульфидную связь между INAD PDZ1 и С-концевым хвостом NORPA в исследовании Kimple et al.Чтобы предоставить дополнительные доказательства, мы протестировали связывание INAD PDZ1 с NORPA PBM или CC-PBM с правильной последовательностью. Анализ поляризации флуоресценции с использованием меченого FITC пептида NORPA PBM (изображение ответа автора 3A ниже) и анализ на основе FPLC (изображение ответа автора 3B) не показал обнаруживаемого связывания между INAD PDZ1 и NORPA PBM или CC-PBM.

    Анализ связывания INAD PDZ1 с NORPA PBM и NORPA CC-PBM.

    ( A ) Анализ поляризации флуоресценции показал, что между пептидом NORPA PBM (TQGKTEFYA) и INAD PDZ1 не было обнаружено взаимодействия. В качестве контроля меченный FITC пептид NORPA PBM связывался с INAD PDZ45 с K d ~ 40 мкМ. ( B ) Анализ FPLC показал, что INAD PDZ1 не взаимодействует с NORPA CC-PBM.

    https://doi.org/10.7554/eLife.41848.023

    8) Несколько ключевых компонентов фототрансдукции мухи собраны белком домена 5-PDZ, INAD, который поддерживает скорость и чувствительность зрения мухи.Однако, хотя передача сигналов ipRGC имеет большое сходство с фототрансдукцией, этот сигнал, по-видимому, не требует высокой чувствительности и скорости передачи сигнала. Следовательно, возникает вопрос, существует ли сигнальный комплекс, подобный INAD, в сигнализации ipRGC. Нет прямых доказательств того, что INADL выполняет in vivo функцию в передаче сигналов ipRGC, как INAD при зрении мух. В фоторецепторных клетках мух с-концевые мутации NORPA вызывали снижение белка NORPA в рабдомерах и серьезные дефекты фототрансдукции в виде медленной активации и деактивации.Пожалуйста, комментируйте и обсуждайте.

    Благодарим рецензента за комментарии. Мы полностью согласны с мнением рецензента и удалили эту часть заключения из рукописи (см. также наш ответ на пункт №5).

    9) Комментарии к конструкциям:

    a) Значения R free кажутся слишком высокими для всех четырех структур. Пожалуйста, проверьте уточнения.

    Спасибо, что указали нам на это. Мы дополнительно уточнили все четыре структуры, и повторно усовершенствованные структуры имеют гораздо лучшие значения R free (показаны в модифицированной таблице структурной статистики в пересмотренной рукописи).Изображение ответа автора 4 ниже показывает статистику наших структур по сравнению с другими структурами при аналогичных разрешениях (сгенерировано программой POLYGON (Уржумцева и др., 2009)). Значения R free теперь находятся в разумных пределах. Кроме того, структуры имеют хорошую геометрию, о чем свидетельствуют значения RMSD связи/угла, а также графики Рамачандрана. Чтобы дополнительно продемонстрировать структурное качество, мы создали поэтапную карту аномалий для двух наборов данных (Se-Met NORPA CC-PBM K884E K898E и PLCβ4 CC-PBM 8KA /INADL PDZ89, полученный из золота) с аномальными сигналами (изображение ответа автора). 5).Пики на аномальной карте (показаны фиолетовым цветом) хорошо перекрываются с аномальными разбросами (то есть атомами Se в Se-Met и Au соответственно).

    Статистика наших четырех структур в сравнении с другими структурами аналогичного разрешения, сгенерированными программой ПОЛИГОН в программном комплексе ФЕНИКС (Уржумцева и др., 2009).
    https://дои.org/10.7554/eLife.41848.024
    Карта фазовой аномальной разности электронной плотности.

    ( A ) Показаны три репрезентативных сайта Se (M974, M1003 и M1053) структуры Se-Met NORPA CC-PBM K884E K898E, а электронная плотность очерчена на уровне 3,0σ. ( B ) Показан один репрезентативный участок золота в структуре PLCβ4 CC-PBM 8KA /INADL PDZ89, полученной из золота, а электронная плотность обозначена цифрой 4.уровень 0σ. Атом золота сопряжен с серой C1047 из PLCβ4 CC-PBM.

    https://doi.org/10.7554/eLife.41848.025

    b) Пожалуйста, покажите карту различий модуля PDZ45 после фазы молекулярной замены NORPA CC 8KA -PBM/INAD PDZ45 (т. е. до моделирования модуля PDZ45).

    В процессе поэтапного молекулярного замещения PDZ45 был помещен после размещения половины NORPA CC (что составляет только 1/4 всей структуры) вместо всего NORPA.Мы едва могли видеть электронную плотность INAD PDZ45. Чтобы показать, что PDZ45 был смоделирован правильно, мы создаем карту исключения, удаляя модуль PDZ45 из окончательной модели. На изображении ответа автора 6 показана карта различий F o -F c модуля PDZ45 на разных уровнях контура (уровни 2,0σ и 2,5σ соответственно). Обратите внимание, что модуль PDZ45 составляет почти половину всей конструкции, поэтому плотность электронов довольно разреженная. Тем не менее, мы все еще можем обнаружить, что смоделированный PDZ45 хорошо перекрывается с плотностью.

    Пропущенная карта, показывающая модуль PDZ45.

    Карта плотности F o -F c создается путем удаления части INAD PDZ45 из окончательной модели и контурируется на 2,5σ ( A ) и 2,0σ ( B ) соответственно.

    https://doi.org/10.7554/eLife.41848.026

    c) Авторы отмечают, что ковалентное связывание INADL PDZ89 с PLCβ4 CC 8KA -PBM было необходимо для получения кристаллов комплекса дифракционного качества. Пожалуйста, дополните. Не было ли дифракции в отсутствие линкера? Также, пожалуйста, предоставьте подробную информацию о процедуре перекрестных ссылок.

    Большое спасибо за вопрос рецензента. После многочисленных испытаний комплекс PLCβ4 CC 8KA -PBM/INAD PDZ89 без ковалентного линкера может быть кристаллизован только в крошечные игольчатые кристаллы, дифрагированные до 5Å.Чтобы улучшить кристалл, мы слили INADL PDZ89 с N-концами PLCβ4 CC 8KA -PBM с линкером из 15 аминокислот (GGGGSGGGGSGGEGS). Это было включено в исправленную рукопись.

    [Примечание редактора: перед принятием были запрошены дополнительные изменения, как описано ниже.]

    Рукопись была улучшена, но остались некоторые проблемы, которые необходимо решить перед принятием, как указано ниже:

    Карта пропуска (изображение ответа автора 6 в опровержении) с опущенным всем модулем PDZ45 довольно фрагментирована, поскольку представляет половину всей структуры.Вместо этого создайте смоделированную составную карту исключения отжига. Кроме того, эта карта и репрезентативные части окончательной карты 2mFo-DFc должны быть включены в дополнительный рисунок.

    В предыдущей версии авторы утверждали, что новое взаимодействие PDZ-PLC опосредует передачу сигналов меланопсином в клетках ipRGC млекопитающих, несмотря на некоторые противоречивые данные. Хотя этот вывод и связанные с ним данные были удалены в этой исправленной версии, разделы «Введение» и «Результаты» по-прежнему подчеркивают потенциальную роль этого взаимодействия в передаче сигналов ipRGC (например, заголовок, второй абзац введения и подраздел «PLCβ4 принимает аналогичный режим привязки к INADL, как NORPA делает с INAD»).Пожалуйста, удалите эти части и обсудите потенциальное участие комплекса PDZL/PLC4 в передаче сигналов ipRGC в конце обсуждения.

    Заголовок также следует смягчить, чтобы избежать недоказанного утверждения, т. е. того, что связывание имеет решающее значение для фотосигнализации дрозофилы.

    В ответ на ваше письмо с решением мы повторно переработали нашу рукопись. Ниже приведены изменения, которые мы внесли в ходе этого раунда проверки:

    .

    1) Мы удалили описания ipRGC как в разделе «Введение», так и в разделе «Результаты».Мы добавили очень краткое обсуждение потенциальной связи взаимодействия между INADL/PLCβ4 на ipRGC. Мы также смягчили название рукописи, изменив название на «Неожиданное связывание PLCβ, опосредованное INAD PDZ, в фоторецепторах Drosophila ».

    2) Следуя вашему предложению, мы сгенерировали смоделированную карту исключения отжига и окончательную карту 2mFo-DFc комплекса INAD PDZ45/NORPA CC-PBM. Эти два рисунка теперь включены как рисунок 2 — рисунок дополняет 3D, E в исправленной рукописи.Качество обеих карт вполне приемлемое.

    https://doi.org/10.7554/eLife.41848.036

    Липидное связывание белков, содержащих домен PDZ, и его решающее влияние на клеточную сигнализацию рассматривался как прототип модуля белок-белкового взаимодействия. Независимые группы недавно обнаружили, что некоторые домены PDZ обладают сродством к связыванию с липидами; однако неизвестно, является ли активность связывания липидов общим свойством доменов PDZ.Мы таким образом выполнили большую характеристику продажи доменов PDZ и обнаружили, что около 30% из 70 охарактеризованных доменов PDZ обладают активностью связывания с мембраной от сильной до средней. Затем мы разработали инструменты биоинформатики на основе наших биофизических данных и предсказали свойство связывания с мембраной всех доменов PDZ. Кроме того, на основе подробного исследования их мембраносвязывающих свойств мы классифицировали все PDZ, связывающиеся с липидами. домены на три подсемейства. Эта работа показывает, что связывание с мембраной является общим свойством доменов PDZ и важно для их физиологических функций.Это также предполагает, что другие домены белок-белковых взаимодействий также могут взаимодействовать с мембраной. липиды. Мы понимаем физиологическое значение мембранного связывания PDZ-доменов и тщательно исследовали свойства двух цитозольных каркасных белков, NHERF1 и Dvl2, которые имеют PDZ-домены с высокой мембранной аффинностью. ПДЗ1 домен NHERF1 содержит общий мотив связывания холестерина, известный как мотив CRAC. Наши подробные биофизические и клеточные исследования показывают, что домен NHERF1 PDZ1 специфически взаимодействует с холестерином, который необходим для клеточной функции NHERF1.Также обнаружено, что PDZ-домен Dvl2 специфически связывает холестерин, хотя в нем отсутствует мотив КРАК. Наши биофизические и биологические исследования показывают, что активность Dvl2 по связыванию холестерина важна для его роли в каноническом пути передачи сигналов Wnt, который контролирует множество онтогенетических и гомеостатических процессов. Самое главное, наши исследования выясняют механизм, с помощью которого Dvl2 может избирательно активировать каноническую передачу сигналов Wnt по сравнению с др. путями передачи сигналов Wnt. В совокупности эти исследования дают новое понимание того, как липиды, включая холестерин, могут регулировать биологические процессы, в том числе клеточные межбелковые взаимодействия.

    История

    Отдел

    Cho, Wonhwa

    градус градус

    Университет Иллинойса в Чикаго

    Градиа Уровень

    Докторантура

    Комитет Участник

    Миллер, Лоуренс Шиппи, Скотт Мин, Юнг-Хён Lu, Hui

    Дата отправки

    2013-12

    Язык

    en

    Дата выдачи

    24/02/2014

    .