Мтз 82 развал схождения передних колес: Регулировка сходимости передних колес тракторов МТЗ-80 и МТЗ-82

Содержание

Регулировка сходимости передних колес тракторов МТЗ-80 и МТЗ-82

Регулировка сходимости передних колес тракторов МТЗ-80 и МТЗ-82

Периодически (через каждые 240 часов работы трактора МТЗ-82 и через 960 часов работы трактора МТЗ-80, а также при каждом изменении колеи передних колес) проверяйте и при необходимости регулируйте сходимость колес (рис. 56). Перед проверкой сходимости обязательно проверьте и при необходимости отрегулируйте зазоры в подшипниках колес и шарнирах рулевых тяг, как указано выше. Для проверки сходимости установите трактор для прямолинейного движения (колеса и сошка параллельны оси трактора), длина левой и правой рулевых тяг, определяемая расстоянием между шаровыми пальцами С, должна быть одинаковой, а корпусы конических пар или поворотные кулаки выдвинуты на одинаковую длину Б соответственно из корпуса и крышки переднего моста и передней оси.

 

 

Рис. 56. Определение сходимости передних колес трактора МТЗ-82 и МТЗ-82Л:

1 — рычаг поворотный; 2 — наконечннк рулевой тяги; 3 — контргайка; 4 — труба рулевой тяги; 5 — пробка контрольная; 6 — шарнир рулевой тяги; 7 — пробка заливная; 8 — контргайка.

 

Для определения сходимости колес замеряют расстояние между внутренними закраинами ободьев спереди (на высоте центров колес) и отмечают мелом места, по которым производились замеры. Затем продвигают трактор вперед настолько, чтобы метки были сзади на той же высоте, и замеряют расстояние между отмеченными точками.

Второй замер должен быть больше первого, разница между вторым В и первым А замерами равна величине сходимости колес и должна быть в пределах 4—8 мм.

Для регулировки сходимости колес отпускают контргайки 16 и 17 (рис. 51) или 3 и 5 (рис. 56) у рулевых тяг и, вращая левые и правые трубы тяг, укорачивают или удлиняют их на одинаковую величину. Затем снова проверяют разность размеров В и А.

После регулировки трубы должны быть надежно законтрены контргайками.

Следует помнить, что неправильно установленная сходимость колес является причиной аварийного износа шин.

 

Как провести ремонт трактора, если его колеса «колебают» и «рыскают»

  Любая техника в процессе работы постепенно изнашивается. Естественно, периодически она нуждается в ремонте. В свою очередь любая неисправность может быть вызвана рядом причин. Если вы заметили посторонние шумы, другие несвойственные действия, стоит в обязательном порядке обратить на это внимание и произвести своевременный ремонт.

С тракторами также часто возникают различные сложности, которые требуют внимания механизатора.  К примеру, передние направляющие колеса со временем начинают «вилять» и колебаться. Особенно это происходит при движении на большой скорости. Чаще всего это говорит об ослаблении затяжки упорных подшипников золотникового гидроусилителя или об их значительном износе.

В данном случае нужно снять крышку распределителя и отрегулировать упорные подшипники золотника сферической гайкой.  Ее следует затянуть моментом не больше 20 Н*м (2 кгс*м), а далее отпускают до совпадения ближайшей гайки прорезина с отверстием в резьбовой части червяка и шплинтуют.

Если колебания уменьшились, но не полностью исчезли, то следует отрегулировать шарниры рулевых тяг. Каждые 1000 ч работы трактора нужно проводить регулировку шарнирных соединений рулевых тяг. Данная проверка осуществляется покачиванием от руки или поворотом рулевого колеса.

Для того, чтобы отрегулировать шарнирное соединение рулевой тяги, нужно выполнить следующие действия:

  1. От наконечника отсоединить контровочную проволоку 33.
  2. Завернуть гаечным ключом пробку 32 таким образом, чтобы убрать зазор в шарнирном соединении.
  3. Обратно законтрить пробку контровочной проволокой.

Виляние передних направляющих колес также может быть вызвано из-за повышенного люфта в конических подшипниках передних колес.

Каждые 1000 ч работы трактора нужно регулировать подшипники ступиц передних колес. В то же время если в процессе работы будет осевое смещение колеса, то его следует незамедлительно устранить, ведь это вызывает ускоренный износ шин и поломку подшипников.

Нормальный осевой зазор  в подшипниках составляет 0,08-0,20 мм.

Чтобы определить осевой зазор, нужно поднять колесо и покачать его в вертикальной плоскости, которая перпендикулярна плоскости вращения. После того, как вы увидите повышенный зазор, или почувствуете усложненное вращение колеса, отрегулируйте подшипники следующим образом:

  1. Открутите болты и снимите колпак 1.
  2. На 1/8 оборота ослабьте гайку 2.
  3. Подтолкните колесо рукой и посмотрите как оно свободно вращается. Если вращение тугое – найдите и  уберите неисправности – может заедать манжета, быть поломанным подшипник и прочее.
  4. При проворачивании колеса от руки, нужно затянуть его до появления повышенного сопротивления вращения колеса. Далее отвинтите гайку на немного, лишь чтобы добиться совпадения ближайшей прорези гайки с отверстием в полуоси под шплинт.
  5. Снова проверьте легкость оборачиваемости колеса.
  6. Теперь можно обратно зашплинтить гайку, на место поставить колпачок, ранее смазав его.

 Виляние передних колес еще может быть из-за нарушения сходимости передних колес.

При заводской регулировке на тракторах МТЗ-80 пределы сходимости передних колес составляют 2-6 мм, для тракторов с ПВМ – 4-8 мм.

Через каждые 500 ч работы нужно проверять и регулировать сходимость колес, также в случае изменения их колеи. Перед самой проверкой следует в обязательном порядке регулировать зазоры в подшипниках колес и шарнирах рулевых тяг.

При регулировке сходимости колес нужно в следующем порядке:

  1. Трактор нужно расположить на горизонтальной площадке, имеющей твердое покрытие.
  2. В среднее положение следует установить сошку. Для этого щуп на датчике автоматической блокировки дифференциала нужно поджать до упора. При поворачивании рулевого колеса установите его в таком положении, чтобы щуп был максимально утоплен.
  3. Нужно отрегулировать правую и левую рулевые тяги, укоротив или удлинив их на одинаковую величину. Для этого отпустите контргайки 3,5,6,8, прокручивая правые и левые трубы и выберите необходимую длину.
  4. Определите сходимость колес. Для этого нужно померить расстояние Г между внутренними закраинами  обода колес впереди (на высоте осей колес) и отметьте мелом в местах замера.
    Затем проедьте на тракторе вперед настолько, чтобы метки были сзади на той же высоте, и замерьте расстояние между отмеченными точками (замер В). Второй замер должен быть больше первого, разница между вторым В и первым Г замерами равна величине сходимости колес и должна быть в пределах 2 – 6 мм (4 – 8 мм для ПВМ).
  5. Снова проверьте установку сошки 10 (рис. 3) в среднее положение (по щупу на датчике АБД) и разность замеров Г и В (рис. 3).
  6. Законтрите трубы рулевых тяг после окончательной регулировки сходимости колес.

Редко происходит колебания (виляние) передних направляющих колес вследствие увеличенного осевого перемещения поворотного вала гидроусилителя. Эта неисправность устраняется с помощью регулировочного болта на крышке гидроусилителя. После регулировки не забудьте зафиксировать болт контгайкой.

 Виляние передних направляющих колес может быть и следствием ослабленой затяжки гаек крепления сошки или поворотных рычагов. Указанные гайки необходимо затянуть.


08.07.2016

Развал схождение

схождение колес


Линейка для проверки схождения колес состоит из нескольких телескопических труб, помещенных одна в другую.

развал схождение колес

Для установления необходимой длины выдвигают правую сторону линейки, которая стопорится в нужном положении фиксаторами 6, входящими в отверстия промежуточной трубы 5. При этом пружина 10 внутри линейки держит постоянно выдвинутой подвижную трубку 1. Это позволяет устанавливать линейку между шинами колес с некоторым распором. Цепочками 11 конусных наконечников 8 линейку устанавливают на нужной высоте.

Стрелка указатель 12 в левой части линейки перемещается относительно неподвижной шкалы 3 с делениями от 0 до 50 мм.

Для проверки схождения колес линейку устанавливают между передними колесами,  так чтобы ее наконечник упирались в боковины покрышек впереди осей вращения колес, а концы обеих цепочек касались площадки. В этом положении линейка удерживается силой упругости сжатой пружины.

Указатель линейки устанавливают на нулевое деление шкалы, прокатывают автомобиль вперед так, чтобы линейка оказалась сзади оси колес, а концы цепочек также касались площадки, и по делениям шкалы определяют величину схождения.

Это как по книге регулировать, я вам расскажу свой способ регулировки схождения колес. Для начала вам нужно соорудить линейку для регулировки схождения колес. Ее можно сделать из штангенциркуля как показано на видео.

ВИДЕО

Такая линейка будет самая точная, лучше заводской. Далее следующий этап это автомобиль. Его нужно проверить на люфты рулевого механизма.

ВАЖНО:

1)Проверяем люфт в шкворнях, если он есть, то меняем втулки и шкворень.

2)Проверяем поперечную тягу на люфт  в пальцах и сухарях. Если есть люфт то меняем наконечники тяги.

3)проверяем колеса на ровность вращения диска. Если колесо крутится восьмеркой, то в в жизни не отрегулируете правильное схождение колес и будет всегда жрать резину. Проверять нужно центровку диска, а не шин, так как регулировка проводится по ободу диска. Только по нему мы сможем определить схождение колес.

4)Устанавливаем линейку по краям диска, фиксируем наш размер. Теперь прокручиваем оба колеса на 180 градусов назад и ставим линейку в теже самые  места и сравниваем размер. Разбег должен быть 3мм в идеале на схождении колес. Устанавливаем 3мм на схождение и пробуем автомобиль на ровной дороге. На скорости в сразу же почувствуете как ведет себя автомобиль. Если автомобиль кидает и тянет то в право то в лево, это значит колеса едут в расхождении по сторонам, нужна регулировка.

Еще момент если у вас жрет одно колесо, это частая проблема, все дело может бть в некачественном изготовлении резины на заводе, слишком много добавлено сажи. Кудабы вы его не поставили его будет жрать хоть на перед хоть на зад. В принципе все что я хотел вам рассказать в регулировке колес на схождение.

СМОТРИТЕ ВИДЕО

Читайте так же

Поделитесь с друзьями в соц сетях

Навигация по записям

Как отрегулировать сход-развал и избежать износа шин трактора

Неравномерный износ шин вашего трактора является ранним предупредительным признаком. Независимо от того, изношена ли шина внутри или снаружи, вероятно, существует проблема с развал-схождением, которая является одной из основных проблем регулировки сельскохозяйственных шин, включая неправильную параллельность.
За определенный период этот дефект может привести к износу шин на 30 % больше, чем если бы проблема была устранена. Это представляет собой значительные затраты для вашей фермы, если учесть стоимость замены шин на вашем тракторе или сельскохозяйственной технике.

Параллельность или угол развала? Как отличить

Параллельность, как и угол развала, связана с неправильным углом наклона колес вашего трактора.

Однако важно понимать разницу между этими двумя проблемами выравнивания, чтобы выполнить правильную настройку.

  • Параллельность – горизонтальная ось колес по отношению к оси оси.
    Если стоять лицом к трактору, колеса должны быть параллельны продольной оси трактора.
  • Угол развала — это угол между вертикальной осью колес, используемых для рулевого управления, и вертикальной осью автомобиля.
    Колеса должны быть идеально вертикальны по отношению к земле, чтобы обеспечить правильное сцепление трактора.

 

Как распознать проблему выравнивания

Имеется несколько предупреждающих знаков о несоосности колес. Внимательно наблюдая за своими шинами, вы можете очень быстро обнаружить проблему.

Вот виды износа, вызванного несоосностью:

  • Шины больше изношены с одной стороны, с внутренней или с внешней стороны.
  • При движении по гладкой поверхности, например по ровной дороге, трактор слегка тянет влево или вправо.
  • Вы можете почувствовать ненормальную вибрацию при ускорении.
  • Вам постоянно приходится регулировать рулевое управление при движении по прямой.

Эти показания могут быть вызваны другими проблемами, такими как уклон поля или дороги (наклонная или выпуклая дорога).
Но, как правило, необходимо исправить развал-схождение, выступы изношены симметрично, внутрь или наружу, на правой или левой шине.

 

Различные виды дефектов: угол развала или параллельность

Развал может быть положительным или отрицательным в зависимости от угла наклона шин по отношению к земле:

  • Положительный развал: , если верхняя часть шины находится дальше, чем нижняя, в контакте с почвой. Это внешние выступы шины, которые чрезмерно изнашиваются.
  • Отрицательный развал: если нижняя часть шины, соприкасающаяся с землей, выступает дальше, чем верхняя часть шины, шина больше изнашивается изнутри.

Говоря о параллельности, мы говорим о схождении внутрь или наружу в зависимости от угла к горизонтальной оси:

  • Схождение: , если передняя часть шины поворачивается внутрь. Это приведет к износу внешней части шин.
  • Схождение: если передняя часть шины вывернута наружу, внутренняя часть шины будет изнашиваться быстрее.

Повреждение правой стороны шины может усугубляться на наклонных или выпуклых дорогах, которые часто встречаются на небольших проселочных дорогах между полями для облегчения дренажа.

 

Что делать в случае перекоса?

Как только вы заметите аномальный износ шин, первое, что нужно сделать, это проверить развал-схождение.
В случае несоосности передние шины обычно изнашиваются больше, чем задние.

  • Если повреждения слишком велики: вам необходимо подумать о замене шин для поддержания тяговой способности вашей машины, а также для вашей безопасности.
  • Если имеются лишь незначительные повреждения и на поврежденной части шин осталось не менее трети высоты выступа, то можно поменять местами шины, чтобы использовать неповрежденные выступы.

Какой бы вариант вы ни выбрали, перед повторным использованием машины необходимо отрегулировать выравнивание.

Как синхронизировать параллелизм?

Для синхронизации параллелизма всегда обращайтесь к руководству пользователя, предоставленному производителем. Как правило, существует небольшой порог допуска, в пределах которого шины не будут повреждены. Этот допуск колеблется от 0 до 2 мм, независимо от того, является ли трактор полноприводным или двухколесным.

Вот различные шаги, которые необходимо выполнить, чтобы проверить, является ли схождение ваших колес чрезмерным:

Первый шаг:
    • Установите трактор на ровную, твердую и устойчивую поверхность.Это необходимо, чтобы гарантировать точность измерений, сделанных позже.
    • Накачайте шины до одинакового давления.

Второй шаг:
    • Измерьте высоту центра ступицы передних колес. Убедитесь, что измерительный инструмент находится строго перпендикулярно земле.
    • Чтобы подтвердить правильность этого измерения, измерьте обе ступицы.


Третий шаг:
    • Отметьте высоту ступицы сбоку обода (спереди и сзади).


Четвертый шаг:
    • Измерьте расстояние между двумя точками соответственно спереди и сзади.
      Если расстояние между двумя задними отметками меньше, чем расстояние между двумя передними отметками, у вас схождение.
      И если расстояние между двумя передними отметками меньше, чем расстояние между двумя задними отметками, то у вас схождение.

Профессионалы часто проводят эти измерения с помощью лазера, который становится все более популярным и доступным инструментом. Всего за несколько кликов вы можете обнаружить несоответствие между передними и задними колесами, не двигая автомобиль.

Как настроить параллелизм?

При обнаружении проблемы с параллельностью необходимо отрегулировать колеса для достижения порога допуска.
Для этого слегка поверните шаровую опору рулевого управления.

  • После снятия контргайки, блокирующей соединение, слегка поверните ее в одну или другую сторону в зависимости от требуемой регулировки.
  • После регулировки еще раз измерьте колеса, чтобы убедиться, что проблема устранена.

Рекомендуется отрегулировать параллельность с отверстием 2 мм, чтобы компенсировать давление, которому подвергается передняя ось во время использования.


СОВЕТ: регулярно проверяйте параллельность

Важно регулярно проверять параметры параллельности вашего трактора. Колеи, вибрация, неровная местность… могут сочетаться друг с другом ежедневно, создавая постепенное схождение или схождение, незаметно для вас.

Периодически вносимые небольшие корректировки могут сэкономить значительную сумму денег.

  • При перекосе в 5 мм ваши шины теряют 12 % срока службы.
  • При 15 мм (схождение внутрь или наружу), это может увеличиться до 26% срока службы ваших шин.

 


Блог Bridgestone-agriculture.eu создается и управляется экспертами по тракторным шинам, которые всегда готовы дать вам совет по поводу ваших сельскохозяйственных шин.Они позволяют максимизировать вашу производительность благодаря информации по всем темам, связанным с шинами: Технические характеристики сельскохозяйственных шин – Характеристики сельскохозяйственных шин – Рекомендации по давлению воздуха – Решения для предотвращения уплотнения почвы – Давление в шинах опрыскивателя – Зачем и как балластировать шины трактора – и т. д. …

Чтобы сделать еще один шаг вперед и повысить прибыльность вашей фермы, les Experts du pneu выпускают бесплатную и очень подробную электронную книгу , в которой объясняется важная роль сельскохозяйственных шин в вашей производительности. .

Большинство людей, прочитавших эту статью, также читали некоторые из следующих статей:

SEC.gov | Порог частоты запросов превысил

Чтобы обеспечить равный доступ для всех пользователей, SEC оставляет за собой право ограничивать запросы, исходящие от необъявленных автоматических инструментов. Ваш запрос был идентифицирован как часть сети автоматизированных инструментов, выходящих за рамки приемлемой политики, и будет управляться до тех пор, пока не будут предприняты действия по объявлению вашего трафика.

Пожалуйста, заявите о своем трафике, обновив свой пользовательский агент, включив в него информацию о компании.

Чтобы ознакомиться с рекомендациями по эффективной загрузке информации с SEC.gov, включая последние документы EDGAR, посетите сайт sec.gov/developer. Вы также можете подписаться на получение по электронной почте обновлений программы открытых данных SEC, включая передовые методы, которые делают загрузку данных более эффективной, и улучшения SEC. gov, которые могут повлиять на процессы загрузки по сценарию. Для получения дополнительной информации обращайтесь по адресу [email protected]

Для получения дополнительной информации см. Политику конфиденциальности и безопасности веб-сайта SEC.Благодарим вас за интерес, проявленный к Комиссии по ценным бумагам и биржам США.

Идентификатор ссылки: 0.5dfd733e.1647752859.1191ff1b

Дополнительная информация

Политика безопасности Интернета

Используя этот сайт, вы соглашаетесь на мониторинг и аудит безопасности. В целях безопасности и для обеспечения того, чтобы общедоступные услуги оставались доступными для пользователей, эта правительственная компьютерная система использует программы для мониторинга сетевого трафика для выявления несанкционированных попыток загрузить или изменить информацию или иным образом нанести ущерб, включая попытки отказать в обслуживании пользователям.

Несанкционированные попытки загрузки информации и/или изменения информации в любой части этого сайта строго запрещены и подлежат судебному преследованию в соответствии с Законом о компьютерном мошенничестве и злоупотреблениях от 1986 г. и Законом о защите национальной информационной инфраструктуры от 1996 г. (см. Раздел 18 USC §§ 1001 и 1030).

Чтобы гарантировать, что наш веб-сайт хорошо работает для всех пользователей, SEC отслеживает частоту запросов на контент SEC.gov, чтобы гарантировать, что автоматический поиск не повлияет на возможность других получить доступ к SEC.содержание правительства. Мы оставляем за собой право блокировать IP-адреса, отправляющие чрезмерные запросы. Текущие правила ограничивают количество пользователей до 10 запросов в секунду, независимо от количества компьютеров, используемых для отправки запросов.

Если пользователь или приложение отправляет более 10 запросов в секунду, дальнейшие запросы с IP-адресов могут быть ограничены на короткий период. Как только количество запросов упадет ниже порогового значения на 10 минут, пользователь может возобновить доступ к контенту в SEC.правительство Эта практика SEC предназначена для ограничения чрезмерных автоматических поисков на SEC. gov и не предназначена и не ожидается, что она повлияет на отдельных лиц, просматривающих веб-сайт SEC.gov.

Обратите внимание, что эта политика может измениться, поскольку SEC управляет SEC.gov, чтобы обеспечить эффективную работу веб-сайта и его доступность для всех пользователей.

Примечание: Мы не предлагаем техническую поддержку для разработки или отладки процессов загрузки по сценарию.

Генетическая изменчивость метаболизма метронидазола и путей окислительного стресса в клинических штаммах Giardia lamblia A и B изолятов

Резюме

Цель: Резистентность к лечению За последнее десятилетие быстро увеличилось количество случаев Giardia .Пока еще не установлены ни маркеры резистентности, ни стандартизированный тест на чувствительность, но несколько ферментов и их пути были связаны с устойчивостью к метронидазолу (MTZ) Giardia . Имеются очень ограниченные данные о генетической изменчивости этих путей. Мы стремились исследовать генетическую изменчивость в генах метаболических путей, которые, как предполагается, участвуют в устойчивости к MTZ у недавно полученных культивируемых клинических изолятов.

Методы: Для расшифровки геномной изменчивости Giardia было проведено полногеномное секвенирование 12 изолятов группы А2 и 8 групп группы В.Двадцать девять генов были идентифицированы в ходе литературного поиска и исследованы на наличие их однонуклеотидных вариантов (SNV) в кодирующих/некодирующих областях генов либо как изменяющиеся аминокислоты (несинонимичные SNV), либо как неизменяющиеся SNV (синонимичные SNV). ).

Результаты. алкогольдегидрогеназа, ферредоксин 4 и ферредоксин 1), чем средняя вариация.Для комплекса Giardia A2 самая высокая генетическая изменчивость была обнаружена в предполагаемых генах ферредоксина 2, ферредоксина 6 и никотинамидадениндинуклеотидфосфата (NADPH) оксидоредуктазы. SNV, обнаруженные в ферредоксинах и нитроредуктазах, были дополнительно проанализированы путем моделирования выравнивания и гомологии. SNV, близкие к сайтам связывания железо-серного кластера в нитроредуктазе-1 и 2 и ферредоксине 2 и 4, потенциально могут влиять на функцию белка. Флавогемопротеин, по-видимому, является геном с вариабельной копией из-за более высокого, но переменного охвата по сравнению с другими исследованными генами.

Заключение: В клинических изолятах Giardia генетическая изменчивость характерна для важных генов в пути метаболизма MTZ и в управлении окислительным и нитрозативным стрессом и включает большое количество несинонимичных SNV. Некоторые из выявленных замен аминокислот потенциально могут влиять на соответствующие белки, важные для метаболизма MTZ.

Ключевые слова:

Ключевые слова: метаболизм лекарств, резистентность, генетический анализ, гены метронидазола, ферредоксин, генетическое разнообразие . 1 Giardia эндемична в странах с низким и средним уровнем дохода (LMIC), и было показано, что заражение этим паразитом влияет на рост и когнитивные функции у детей в регионах с ограниченными ресурсами. 2 , 3 В странах с высоким уровнем дохода Giardia обычно передается вспышками через воду или обнаруживается у возвращающихся путешественников из СНСД. 4 , 5 Лямблиоз клинически связан с длительной диареей и болями в животе и может привести к постинфекционным последствиям, например, синдрому раздраженного кишечника и хронической усталости. 6 , 7

Антибиотик метронидазол (МТЗ) является пролекарством, принадлежащим к химической группе 5-нитромидазола, и широко применяется при лечении лямблиоза первой линии. 8 Обладая активностью в отношении микроаэрофильных и анаэробных возбудителей, МТЗ имеет эффективность лечения 73–100%. 9 MTZ проникает в паразита путем пассивной диффузии, активируется путем ферментативного восстановления и высвобождает токсичные промежуточные продукты. Эта реакция может происходить только в анаэробной или микроаэрофильной среде. 10 , 11 Эффекты активированного MTZ на восприимчивых Giardia включают нарушение работы белков, нарушение размножения, повреждение ДНК и окислительный стресс, которые приводят к гибели клеток. 12 15 MTZ может быть активирован четырьмя основными ферментами в Giardia : пируват-флаводоксиноксидоредуктазами (PFOR-1 и 2), ферментом, связанным с циклом тиолов, тиоредоксинредуктазой (TrxR) 16 (НР)-1.Также было показано, что железо-серные (Fe-S) кластерные белки, ферредоксины (Fd), участвуют в активации MTZ у Giardia . 16 Предполагается, что NR-2, аналог NR-1, детоксифицирует MTZ за счет полного снижения количества препарата без образования токсичных промежуточных продуктов. 17 19 В то время как Giardia подвергается воздействию MTZ, он также должен постоянно детоксицировать кислород, оксид азота (NO) и другие вредные химические вещества, которые могут повлиять на рост и жизнеспособность. 20

Большинство предложенных механизмов резистентности состоят либо в подавлении ферментов, которые делают MTZ цитотоксическим (NR-1, PFORs и TrxR), либо в повышении активности ферментов, которые могут сделать MTZ инертной молекулой (NR-2). ). 19 Большая часть работы, посвященной механизмам лекарственной устойчивости у Giardia , была проведена с использованием лабораторно индуцированных устойчивых изолятов группы A1, которые редко инфицируют человека, по сравнению с инфекциями, вызываемыми Giardia сборками A2 и B, которые распространены.MTZ, вероятно, активируется несколькими путями и проявляет плейотропный механизм действия, а для развития устойчивости к MTZ обычно требуется больше времени по сравнению с устойчивостью к большинству других антибиотиков. 21

Устойчивость MTZ к Giardia становится все более серьезной проблемой. Клинический опыт и недавние исследования вернувшихся путешественников показали, что MTZ-рефрактерные случаи Giardia имеют распространенность ~ 20%. 22 , 23 Распространенность резко увеличилась за последние несколько лет, достигнув 40% в специализированной амбулаторной клинике в Лондоне. 24 Самая высокая распространенность рефрактерных случаев MTZ была обнаружена у вернувшихся путешественников из Азии, особенно Индии, или из районов южного и восточного Средиземноморья. 22 , , , 26

Без стандартизированных анализов восприимчивости для Доступны Изоляты , 27 и тестирование восприимчивости в лаборатории сложно из-за геномной сложности паразита. Кроме того, изоляты трудно культивировать, а скорость роста может различаться между изолятами и группами.Микроаэрофильная среда, в которой процветает Giardia , трудно воспроизвести in vitro для анализа чувствительности к лекарственным средствам. Эксперименты можно проводить при неблагоприятных высоких уровнях O 2 , влияющих на скорость роста и метаболизм MTZ Giardia . Таким образом, может быть трудно получить надежную оценку активации и толерантности MTZ. 28 Исследования генов путей метаболизма MTZ у Giardia в основном основаны на анализе экспрессии генов в изогенных лабораторных резистентных штаммах Giardia из группы штаммов AI, редко встречающихся у людей. 13 , 18 , 29 34 До сих пор не было обнаружено специфических маркеров резистентности у Giardia на основе нескольких факторов резистентности. Эти факторы могут включать вариации аминокислот в белках и измененную функцию, пост- или претрансляционные варианты, изменения в экспрессии активирующих или защитных белков, модификации регуляторных путей и эпигенетические модификации, 39 и недавнее исследование резистентных штаммов Giardia показали, что MTZ способен индуцировать значительные изменения в белках, обнаруживаемых в сетях антиоксидантов, транспорта электронов и катаболизма пирувата. Кроме того, была обнаружена корреляция между ацетилированием этих белков и резистентностью к MTZ. 35

Begaydarova et al. 2015 исследовали клинические изоляты и связали экспрессию гена PFOR с устойчивостью к MTZ, но PFOR не оказался хорошим маркером устойчивости. 40 Другое исследование, проведенное Galeh et al. 2016 41 , связывает несинонимичные однонуклеотидные варианты (nsSNV) в генах PFOR и NR с устойчивостью к MTZ и, возможно, за счет снижения трансляции и, таким образом, снижения активации MTZ.Генетическая изменчивость в геноме Giardia недостаточно известна, за исключением нескольких генов генотипирования, т. е. триозофосфатизомеразы ( tpi), глутаматдегидрогеназы ( gdh ) и бета-гиардина bg ( bg ). . 42 Генетическая изменчивость среди изолятов Giardia в одном исследовании оказалась низкой для некоторых генов сборки A, то есть Fd3 (DHA2_154390) с большим количеством SNP в группе B. 43 Пути метаболизма паразитами MTZ и управление окислительным и нитрозативным стрессом подробно не исследовались и составляют важную основу для дальнейших исследований потенциальных маркеров устойчивости к MTZ.

Лабораторно-индуцированная резистентность к MTZ может быть утрачена в течение одного цикла энтерации/эксцистации, 44 указывает на то, что метаболические адаптации, вероятно, способствуют резистентности. Тем не менее, недавнее появление быстро растущей клинической резистентности к MTZ вызывает подозрение, что в настоящее время циркулируют штаммы с генетически наследуемым признаком устойчивости. Действительно, было показано, что одна лабораторно-индуцированная резистентная линия обладает бессмысленной мутацией в одном из своих аллелей NR-1. 16 Тем не менее, эту проблему лучше всего изучать, исследуя текущие клинические изоляты, а не лабораторные штаммы, полученные десятилетия назад.Перспектива полногеномного секвенирования очищенных кист из образцов клинического стула делает возможным проведение таких исследований. 45 Целью нашего исследования было изучение общей генетической изменчивости белков, участвующих в метаболических путях, связанных с устойчивостью к MTZ или управлением веществами окислительного стресса.

Материалы и методы

Интересующие гены

Поиск литературы в PubMed был проведен с использованием слова Giardia в сочетании с одним или двумя словами: MTZ, рефрактерный, резистентный и окислительный стресс, для идентификации генов, участвующих в метаболизме MTZ. путь и управление окислительным и нитрозативным стрессом у Giardia .Поиск был направлен на выявление генов, которые активировались или подавлялись при воздействии MTZ и/или свободных радикалов или были связаны с активацией или инактивацией MTZ, а также генов с антиоксидантными свойствами. Эти публикации и ссылки на них были использованы для составления списка из 29 генов-кандидатов (см. Ресурсы). Чтобы идентифицировать попарно общие гены и правильный идентификатор гена для сборки Giardia A2 и B, были использованы дополнительные данные от Adam et al. 46 Наконец, база данных Giardia (http://giardiadb.org) использовали для поиска ортологов и паралогов генов. Для генов NR, проанализированных в этом исследовании, для ясности использовались аннотации NR-1 и NR-2. NR-2 также известен как GlNR1/Fd-NR2 (идентификатор гена: Gl50803_22677), а NR-1 — как GlNR2/Fd-NR1 (идентификатор гена: Gl50803_6175). Для двух генов PFOR-1 и 2 литературные аннотации противоречили друг другу, и в базе данных Giardia не удалось найти больше спецификаций. Аннотации, используемые для PFOR в этом исследовании, соответствуют GenBank. Аннотации Fd, используемые в нашем исследовании, основаны на Müller et al 2008 и Ansell et al 2017. 16 , 47 Один гипотетический Fd, представленный Nixon et al 2002 48 и Ansell et al 2017, 16 Fd5, не удалось найти ни в референсных геномах GenBank, ни в геномах Bunk A2, ни с помощью A2. Другой гипотетический Fd (DHA2_153401 и GSB_151614) в таблицах и рисунках был назван Fd6. Некоторые из предполагаемых Fd, представленных в этом исследовании, на самом деле могут быть доменами в более крупном белке, но представлены как отдельные Fd до тех пор, пока не станет известно больше.

Таблица 1

Гены, включенные в анализ SNV для метаболизма метронидазола, управления окислительным и нитрозативным стрессом.Ферредоксины были названы в соответствии с Ansell et al 2017, 16 , а другой Fd, DHA2_153401/GSB_151614, ранее представленный Nixon et al 48 , получил в этой таблице название Fd6. Другие интересующие гены были названы в соответствии с аннотациями из Giardia DB

Включены гены-кандидаты ID гена Функция белка. ссылки
0 120508 9 48 54,78 GSB_150173 12,20,37,76 1 -Peroxiredoxin GSB_153801 DHA2_152385
Сборка B
Nitroreductase FD-NR1 DHA2_153380 GSB_153178 MTZ Activation. 17,18,37,48
Нитроредуктаза Fd-NR-2 (NR-2) DHA2_22677 GSB_22677 Детоксикация МТЗ. 34,48
Белок семейства нитроредуктаз (NTR-1) DHA2_15307 GSB_15307 Upreg. при воздействии МТЗ. Ферредоксиновый домен отсутствует. 15,48,77
-Ферредоксин (Fd1) DHA2_9662 GSB_9662 Предполагаемые кофакторы для PFOR-1 и .2 для активации MTZFd3 является гипотетическим белком, родственным ферредоксинам. 16,32,37,43,48 54,68
-ферередкин, 4FE-4S (FD2) DHA2_10329 GSB_10329
-2FE-2S Ferredoxin (FD3) DHA2_154390
-Putative оксидоредуктазы 4Fe-4S (Fd4) DHA2_151386 GSB_153527
-4Fe-4S-связывающий домен белка семейства (Fd6) DHA2_153401 GSB_151614
А-типа флавопротеин кандидат на латеральный перенос DHA2_10358 GSB_10358 O 2 – поглощающий фермент в окислительно-восстановительной системе. 20,28,79
Тиоредоксинредуктаза (TrxR) DHA2_9827 GSB_9827 Снижение содержания флавинов и активация MTZ. 13,20,32,36,37,39,80,81
Тиоредоксин-подобный белок (Trx) DHA2_9355 GSB_9355 Эндоксиновый фор. 20,32,37,47,81
-Тиоредоксинпероксидаза (prx 1) DHA2_14521 GSB_14521 Антиоксидантная система; предложил детоксикацию пероксинитрита для предотвращения гидроксильного радикала и детоксикации H 2 O 2 до H 2 O.
-Thioredoxin пероксидазой (PRX 1) DHA2_15383 GSB_15383
DHA2_153915
-Thioredoxin пероксидазой GSB_151294
33 ,81
–pyruvate-flavodoxin OxidOreductuctazeuctase (PFOR-1) DHA2_114609 GSB_114609 Декарбоксилат Пируват в ацетил-COA и отправляют избыток электронов до ферредоксина через кластеры железа-серы. Также можно активировать МТЗ путем частичного снижения. O 2 чувствительный. 15,16,17,30,32,33337,47,81
–pyruvate-flavodoxin Oxidoodooductase (PFOR-2) DHO2_17063 GSB_17063
H3A DHA2_152990 GSB_151412 Воздействие MTZ вызывает фосфорилирование гистона h3A. Повышенная регуляция в устойчивых Giardia . 13,47,82
Флавогемопротеин DHA2_154000 GSB_151570 Детоксикация NO95-зависимого до нитрата (O ). 16,20,36,37,73–76
Десульфоферредоксин (SOR) DHA2_152891 GSB_153135 Железозависимый фермент. В присутствии донора электронов он разлагает супероксидный анион до H 2 O 2 . 20,36,76
-Алкогольдегидрогеназа DHA2_13350 GSB_13350 Алкоголь- и ацетальдегиддегидрогеназа. Вниз рег. при воздействии H 2 O 2 и MTZ и может регенерировать НАД в анаэробных условиях. 12,15,36 37,39,48,81,63
– Спиртные дегидрогеназы E DHA2_93358 GSB_93358
Coa-Disulfide Reductase NAD (P) H DHA2_33769 GSB_33769 Снижает образование АФК/защищает O 2 -лабильные белки. 15,20,37,84
НАДН-оксидаза DHA2_9719 GSB_9719 Водообразующая активность по H 2 Основной вклад в электронный путь. Он защищает чувствительные белки O 2 . 15,16,20,37,39,48,81,84
НАДФН-оксидоредуктаза предполагаемая DHA2_17151 GSB_17151 Upreg. при воздействии МТЗ и воздействии H 2 O 2 , но в пониженном диапазоне. в условиях стресса, вызванного МТЗ. 15,17,47
NADPH-оксидоредуктаза предполагаемая DHA2_17150 GSB_17150 Upreg. во время MTZ/H 2 O 2 экспозиции, но занижен. в условиях стресса, вызванного МТЗ. Может восстанавливать O 2 до супероксида и H 2 O 2 и вносить вклад с АФК. 16,17,47,85
Ацетил-КоА-синтетаза DHA2_13608 GSB_13608 Ацетил-КоА используется в качестве субстрата для получения микроаэрофильного АТФ. 37,48,83
Малатдегидрогеназа DHA2_3331 GSB_3331 Активируется при воздействии H 2 5 O 2. 15
НАДФ-специфическая глутаматдегидрогеназа (ГДГ) DHA2_21942 GSB_21942 Антиоксидантный фермент в метаболизме НАДФН. Вниз рег. в стойких линиях. 34,36,86

Изоляты Giardia

Двенадцать изолятов Giardia сборки A2 и восемь изолятов сборки B были выделены из клинических образцов стула человека в Берлине, Институте Роберта Коха в Германии в 2011 г. и 2011 г. .Образцы стула были собраны Институтом тропической медицины и международного здравоохранения, Шарите, Берлин, Германия. Один из изолятов, P324, был получен из Tropenmedizinische Ambulanz, Университетская клиника Дюссельдорфа, Германия. Клинические данные для образцов не были собраны. цист Giardia из образцов стула очищали с использованием двухэтапного центрифугирования в градиенте сахарозы. Кисты были эксцистированы с использованием стандартного двухэтапного метода эксцистации, 49 , для получения трофозоитов.Трофозоиты выращивали на среде Даймонда TY-S-33 с добавлением желчи при 37°С по методике. 50 Сбор трофозоитов проводили из конфлюэнтных культур в пробирках объемом 11 мл, а затем ДНК экстрагировали с использованием набора для очистки ДНК Maxwell® 16 FFPE Plus LEV (Promega BioTech AB, Швеция, кат. AS1135) вместе с инструментом Maxwell® 16 ( АС1000). Качество и количество ДНК проверяли с помощью NanoDrop, а концентрацию ДНК проверяли с помощью Qubit 2.0 (Life Technologies, Гранд-Айленд, Нью-Йорк).

Секвенирование генома

Фрагментированная ДНК Giardia (2 мкг, размер вставки 550 п.н.) из трофозоитов была сначала подготовлена ​​и проиндексирована с использованием набора для подготовки образцов Illumina TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit (кат. № 20015962 и 20015960S). Распределение размера библиотеки было проверено с использованием биоанализатора Agilent Technologies 2100 BioAnalyzer, высокочувствительного ДНК-чипа, а количественная оценка была выполнена с использованием набора для количественного анализа библиотеки KAPA для платформ секвенирования Illumina. Нормализованные полногеномные ДНК-библиотеки Giardia секвенировали с использованием технологии парных концов Illumina MiSeq (2×300 п.н.).FASTQ-файлы секвенирования были собраны и сопоставлены с соответствующими эталонными геномами Giardia сборки A2 и B (v. 26) с использованием Bowtie 2-2.2.3. 51 Эталонные геномы были получены из базы данных Giardia в январе 2016 г. версии 2013-11-25. 52

Анализ вариантов

Выровненные данные были проанализированы с помощью Geneious v.10.2.4. Вызов вариантов был выполнен для идентификации SNV с использованием параметров минимальной частоты вариантов 0,1 и минимального охвата 10 нуклеотидов.Кодирующие области (CDS) 29 генов-кандидатов (включая пре-, 150 п.н., – и пост-кодирующие области, 50 п.н.) были извлечены из Giardia сборок A2 и B в Geneious. Для генов с интронами (Fd3 в обоих наборах) генетический анализ был проведен в CDS, поэтому SNV в интронах не представлены. Чтобы получить все SNV в одном выравнивании, 29 генов из каждого изолята были объединены, а затем по совокупности сравнивались друг с другом. Сравнение 29 генов также было выполнено в Geneious с использованием глобального выравнивания со свободными концами.Выравнивание доменов ферредоксина основано на выводах Nixon et al 2002, 48 , а более подробную информацию см. в дополнительном материале. Для каждого гена использовалось общее количество возможных позиций SNV. SNV были разделены на nsSNV или синонимичные SNV (sSNV) в кодирующих областях или как SNV в некодирующих областях. Соотношения для sSNV и nsSNV были рассчитаны для каждого гена.

Моделирование гомологии нитроредуктаз и ферредоксинов

Моделирование гомологии NR и ферредоксинов 1–6 было выполнено на основе аминокислотных последовательностей, использованных в генном анализе.Модели были созданы с использованием сервера Protein Homology/analogY Recognition Engine V 2.0 (Phyre2) в интенсивном режиме. 53 Модели визуализировались и накладывались в PyMol (Система молекулярной графики PyMOL, версия 2.1.0 Schrödinger, LLC).

Хранение данных

Все генетические данные хранятся на защищенном сервере; Норвежская электронная инфраструктура для наук о жизни.

Результаты

Полногеномное секвенирование 20 культивируемых изолятов Giardia сборки A2 и B было успешно выполнено со средним охватом 31. 1 (110,3) (см. Таблицу S1) для 29 представляющих интерес генов. Было обнаружено, что флавогемопротеин (DHA2_154000 и GSB_151570) имеет значительно более высокое покрытие (87,6 (54,2)), при этом в общей сложности 17 из 20 изолятов Giardia сборки A2 и B имели покрытие выше среднего.

На основании критериев поиска литературы было отобрано 29 генов-кандидатов, которые представлены в .

Генетическая изменчивость 29 генов-кандидатов была проанализирована в 12 клинических изолятах группы A2 и восьми группах B.Среднее количество nsSNV на длину гена составило 0,3% для сборки A2 и 1,2% для сборки B. Средние значения SNV для каждого гена представлены в таблице S2. Было обнаружено, что один из генов в этом исследовании, Fd3, имеет интрон 35 п.н. в сборке А2 и интрон 36 п.н. в сборке В, что подтверждает более ранние результаты. 43 , 54

Гены, участвующие в MTZ и управлении окислительным стрессом и нитрозативным стрессом

Значительно больше nsSNV может быть обнаружено в сборке Giardia изолятов2, чем в изолятах A2. Таким образом, цветовая тепловая карта nsSNV, вызывающих аминокислотные изменения в 29 белках, участвующих в метаболизме MTZ, управлении окислительным и нитрозативным стрессом, показана только для сборки Giardia B (). Генетическая изменчивость флавогемопротеина (GSB_151570) не проиллюстрирована из-за высокой частоты SNV и значительно более высокого охвата, чем в среднем.

Тепловая карта белков в метаболизме метронидазола и управлении окислительным/нитрозативным стрессом в сборке Giardia B.Метронидазол (MTZ) пассивно диффундирует через мембрану трофозоита и должен быть активирован в токсичные промежуточные соединения, чтобы выполнять свою функцию антибиотика. Для MTZ существует несколько теоретических промежуточных продуктов. МТЗ может быть активирован либо через ферменты пируват: ферредоксиноксидоредуктазу (ПФОР)-1 и/или 2 с ферредоксином (fd) в качестве кофактора, нитроредуктазу-1 с флавинмононуклеотидом (ФМН) в качестве кофактора или тиоредоксин редуктазы с окислительно-восстановительным кофактором флавинадениндинуклеотидом (ФАД). МТЗ также может превращаться в инертный метаболит с помощью фермента нитроредуктазы-2. MTZ-NO, образующийся при активации, может реагировать с O 2 и создавать реакционноспособную свободнорадикальную молекулу пероксинитрита (ONOO ). Для удаления токсичных свободных радикалов многие ферменты проявляют защитные функции, например, ферменты тиоредоксинпероксидазы могут превращать пероксинитрит в безвредную молекулу нитрата (NO 3 ). Свободнорадикальная форма NO · может быть преобразована в нитраты с помощью флавогемопротеина (зависимая реакция O 2 ).В микроаэрофильной среде Giardia многократно подвергается воздействию вредных O 2 /O 2 . O 2 может метаболизироваться в H 2 O 2 посредством десульфоферредоксина (SOR), а затем H 2 O 2 превращается в H 2 O с помощью фермента тиоредоксинпероксидазы. O 2 также может быть преобразован в H 2 O с помощью ферментов НАДН-оксидазы или O 2 очищающего фермента флавопротеина.Другие ферменты могут вызывать образование свободных радикалов в Giardia, , т. е. NADPH-оксидоредуктаза, предположительно, вносит вклад в активные формы кислорода (АФК) из-за превращения O 2 в более реактивную форму свободных радикалов (O 2 ). Другим фактором, влияющим на АФК, является восстановленная версия тиоредоксина, которая может инициировать неправильное сворачивание белка. Цветовая градация белков представляет собой количество позиций nsSNV на длину каждого гена. *Тиоредоксинредуктаза активна как в метаболизме МТЗ, так и в восстановлении белка тиоредоксина.**Флавогемопротеин является предполагаемым мультикопийным геном, и количество SNV не определено и не представлено цветом на тепловой карте.

Для двух генов с наибольшей частотой генетической изменчивости в сборке B (GSB_151294 – тиоредоксинпероксидаза и GSB_153178 – NR-1) nsSNV составляли более 4% нуклеотидов в гене, и только два гена оказались без каких-либо nsSNV (гистон h3A; GSB_151412 и Fd6; GSB_151614). Средний процент любого SNV на длину CDS составлял 5.4% в Giardia сборки B и 1,1% в сборке A2.

Было показано, что большинство генов имеют по крайней мере один sSNV, за исключением четырех генов Fd3; DHA2_154390, NR-1; DHA2_153380, Fd1; предполагаемые DHA2_9662 и НАДФН-оксидоредуктаза; DHA2_17151 в сборке А2. sSNV присутствовали во всех генах в наборе B. Было показано, что количество SNV в пре-CDS-областях выше в наборе B (в среднем 10,1 SNV в 150 п.н.), чем в наборе A2, где среднее значение составило 1,1 SNV на 150 п.н. бит/сОбласти после CDS в целом имели более низкую вариабельность (0,3 в A2 и 4,2 в B для 50 п.н.).

Нитроредуктазы

Три различных NR были исследованы на наличие SNV в этом исследовании: NR-1, NR-2 и нечувствительный к кислороду NTR-1. NR-1 имел одно из самых высоких количеств nsSNV (4,1%) для Giardia сборки B, с большим количеством nsSNV, чем sSNV в CDS. Однако количество SNV в некодирующих областях NR-1 в сборке B было ниже среднего. Было обнаружено, что ген NR-1 в сборке A2 полностью консервативен без каких-либо SNV в кодирующих или некодирующих областях. .Последовательность гена NR-2 также имела большое количество nsSNV в сборке B Giardia (2,1%), а количество SNV в пре-CDS-областях было выше среднего (21 против 10,1 из 150 п.н.). NR-2 в сборке Giardia A2 имел небольшое количество SNV, из которых только один был nsSNV. Ген NTR-1 был полностью консервативен в сборке A2, и количество несинхронных SNV в B было ниже среднего. 2, и изменения в этих кофакторах могут потенциально повлиять на их функцию, связывание и роль.Мы обнаружили, что три ферредоксина в изолятах группы Giardia B, Fd2; GSB_10329, Fd4; GSB_153527 и Fd1; GSB_9662, имел большее количество nsSNV, чем в среднем 1,2% (соответственно 3,1%, 1,7% и 1,7%). Интересно, что Fd2 был одним из белков с наибольшим количеством SNV в пост- и пре-CDS областях среди всех генов, исследованных в сборке B, а также имел большое количество nsSNV в кодирующей области.

Для сборки Giardia A2 два ферредоксина имели большее количество nsSNV, чем в среднем 0.3% соответственно Fd2; DHA2_10329 (2,1%) и Fd6; DHA2_153401 (1,1%). Одним интересным открытием было то, что Fd6 был полностью законсервирован в сборке B Giardia , в то время как в сборке A2 присутствовали некоторые SNV.

Антиоксидантные и метаболические белки

Было показано, что два фермента защиты от свободных радикалов, prx (GSB_151294) и НАДН-оксидаза (GSB_9719), а также метаболический протеин алкогольдегидрогеназа (GSB_13350) имеют большее количество nsSNV в сборке B, чем в среднем.Анализ после CDS показал, что TrxR; GSB_9827 был одним из белков с наибольшим количеством SNV, в то время как предполагаемая НАДФН-оксидоредуктаза; GSB_17150, два prxs, GSB_153801 и GSB_14521, малатдегидрогеназа; GSB_3331, флавопротеин; GSB_10358 и алкогольдегидрогеназа; GSB_13350, у всех было больше SNV после CDS, чем в среднем.

Выравнивание ферредоксинов и нитроредуктаз

Было обнаружено, что некоторые из ферредоксинов и NR имеют большое количество nsSNV во многих изолятах Giardia совокупности A и B. Поэтому SNV, изменяющие аминокислоты, и их положения в белках были проанализированы дополнительно, и было проведено выравнивание для сравнения цистеиновых доменов в пяти различных белках ферредоксина, включенных в этот анализ, в дополнение к NR-1 и NR-2 и гипотетический Fd. ранее описанный в WB (Fd5) 48 Белки NR1, Fd1 и Fd3 в сборке A2 и Fd3 и Fd6 в сборке B не имели nsSNV в своих доменах ферредоксина. nsSNV, расположенные вокруг остатков цистеина в доменах ферредоксина, ответственных за формирование сайтов связывания кластеров Fe-S (сайтов переноса электронов), показаны на рис.

Выравнивание ферредоксинов (Fd1-Fd6) и нитроредуктазы 1 и 2. Генетическая изменчивость представлена ​​альтернативными аминокислотами в исходных белковых последовательностях. Было обнаружено, что ферредоксин 5 является неохарактеризованным белком и не аннотирован в геномах DHA2 и GSB и, таким образом, представлен гипотетической последовательностью из Giardia WB. Представлены только домены ферредоксина на N-конце белков, а домен редуктазы нитрофлавинмононуклеотида (FMN) на С-конце NR не показан. Остатки цистеина, ответственные за формирование кластеров железо-сера, заштрихованы черным или пурпурным цветом, чтобы показать, как остатки соединяются. * конец белка, + белок был вырезан и показан только домен ферредоксина.

Моделирование гомологии доменов ферредоксина

Чтобы иметь возможность анализировать влияние замен аминокислот, использовали моделирование гомологии. Представленное выравнивание последовательности домена ферредоксина и предполагаемые остатки цистеина для связывания кластеров Fe-S кодируются теми же цветовыми кодами, как показано в моделях гомологии доменов на .Моделирование гомологии указывает на различные различия в доменах ферредоксина.

Мультипликационная пробирка с гомологическими моделями доменов ферредоксина нитроредуктазы (NR) и ферредоксинов (Fd) 1–6. Остатки цистеина, ответственные за связывание железо-серного кластера [Fe4-S4], представлены палочками, окрашенными в темно-серый и красный цвета для кластеров 1 и 2 соответственно. Для мутаций, вызванных SNV, исходный аминокислотный остаток показан палочкой, а возможные мутации отмечены однобуквенным кодом.( A ) NR1_A2 (серый), NR2_A2 (голубой), NR1_B (желтый) и NR2_B (коричневый) ( B ) Fd1_A2 (серый), Fd2_A2 (голубой), Fd1_B (желтый) и Fd2_B (коричневый) ( C ) Fd3_A2 (серый), Fd3_B (голубой). Расширенный С-конец на рисунке обрезан и отмечен звездочкой. ( D ) Fd4_A2 (серый), Fd4_B (голубой). ( E ) Fd5_WB (серый) ( F ) Fd6_A2 (серый), Fd6_B (голубой).

Fd1, Fd2 и Fd4 могут быть наложены на домены ферредоксина NR-1 и 2.Все они явно имеют два цистеиновых мотива, по четыре цистеина в каждом, способных связывать кластеры Fe-S, вероятно, типа 4Fe-4S. 55 , 56 Остальные ферредоксины отличаются от остальных формой и способностью связывать кластеры Fe-S. Fd6 имеет два цистеиновых мотива, но один из мотивов имеет только три координирующих цистеина вместо четырех, что может указывать на то, что Fd6 может связывать только один кластер 4Fe-4S или потенциально один кластер 4Fe-4S и дополнительный кластер 3Fe-4S (связанный с 3-цистеиновый мотив). Fd3 имеет только один четкий мотив для связывания кластера 4Fe-4S и, кроме того, он имеет предполагаемый удлиненный С-конец. Fd5 имеет как удлиненный N-, так и C-конец.

Некоторые аминокислотные замены были расположены близко к домену ферредоксина с цистеинами, связывающими кластер Fe-S, и достаточно различались по заряду или гидрофобности, чтобы потенциально вызывать изменения, достаточно значительные, чтобы влиять на функцию белка. Некоторые из аминокислот в доменах ферредоксина экспонированы на поверхности, и изменения здесь потенциально могут повлиять на способность белков взаимодействовать с другими белками в возможных межмолекулярных переносах электронов.Эти изменения включают замену положительно заряженной аминокислоты, такой как K, на отрицательно заряженную E или D, наблюдаемую в сборке B NR-1, или замену E на K в сборке A2 Fd2 и сборке B Fd2, где G заменен на R.

В NR-1 из сборки B S может быть заменен на P (поз. 70), а в NR-2 из A2 P может измениться на S (поз. 41 в ), что может изменить конформацию белковый остов, так как Р структурно более жесткий, чем другие аминокислоты. Эти SNV расположены рядом или между двумя цистеинами, координирующими связывание кластера Fe-S в NR-1 и NR-2 соответственно.SNV, которые потенциально могут оказывать влияние на электростатические свойства кластеров Fe-S, представляют собой изменение G на R (поз. 66) в NR-2 из сборки B и G в E (поз. 38) изменение Fd4 из сборки B.

Обсуждение

Геном трофозоитов Giardia тетраплоидный, состоящий из двух диплоидных ядер. Таким образом, изменчивость среди сообществ и внутри них может быть высокой. В нашем исследовании мы показываем, что nsSNVs являются общими в исследованных генах в культивируемых клинических изолятах Giardia сборок A2 и B.В целом, Giardia , сборка B, имеет большее количество SNV в 29 исследованных генах, и это хорошо согласуется с более ранним открытием, что гетерозиготность аллельной последовательности (ASH) в сборке B составляет до 0,53%, 57 , тогда как ASH двух Было определено, что изоляты A2, AS-98 и AS-175, составляют 0,25–0,35%. 46 В наборе B Giardia особенно большое количество nsSNV было обнаружено в генных последовательностях, кодирующих MTZ-активирующий фермент NR-1, кофакторы PFOR Fd2, Fd1 и Fd4, защитные ферменты prx и NADH-оксидазу, метаболический фермент алкогольдегидрогеназа, в дополнение к MTZ, инактивирующему фермент NR-2.В сборке A2 последовательности генов Fd2, Fd6 и фермента, вносящего вклад в АФК, НАДФН-оксидоредуктазы, предположительно, имели наибольшее количество nsSNV.

Моделирование гомологии показывает, что некоторые SNV, меняющие аминокислоты, находятся в непосредственной близости от остатков цистеина, ответственных за формирование кластеров Fe-S, и потенциально могут влиять на аффинность связывания белков NR-1, NR-2, Fd2 и Fd4 или как они могут выполнять свою роль в качестве белков, переносящих электроны.

Генетическая изменчивость как маркеры потенциальной резистентности

Большое количество nsSNV, обнаруженное в изолятах группы B Giardia , может указывать на то, что группа B мутирует быстрее, чем группа B изолятов группы A2. Более высокие частоты вариаций, обнаруженные у изолятов B, могут быть связаны с большей функциональной изменчивостью, более высокой распространенностью заболевания у людей и более высокими показателями рефрактерных к лечению случаев. 58 , 59

Недавнее исследование 41 с использованием клинических изолятов Giardia показало, что nsSNV в генах NR-2 и PFOR могут быть связаны с устойчивыми изолятами 2 Giardia только на двух резистентных к лечению изолятах.Кроме того, это исследование дает потенциальные доказательства того, что в геноме могут существовать разные гаплотипы этих двух генов. Это открытие коррелирует с нашим наблюдением, что количество nsSNV в белке NR-2 в сборке B Giardia было выше среднего. Было обнаружено, что PFOR в нашем исследовании имеют меньшее количество nsSNV, чем в среднем. Однако было обнаружено, что кофакторы для PFOR, Fds, сильно варьируют в пределах трех из пяти Fd в комплексе B и двух Fd в Giardia в комплексе A2.

Предполагается, что роль фермента, активирующего MTZ, PFOR, заключается в переносе электронов через связанные кластеры Fe-S к растворимым Fd. 38 Более низкие уровни активности фермента PFOR и ферредоксина были характерны для резистентных культур Giardia и также были связаны с чувствительностью MTZ у клинических изолятов. 16 , 32 , 60 , 61 Экспрессия гена PFOR, однако, не оказалась существенной по сравнению с изолятами пациентов с различными штаммами MTZ. 40

У других анаэробных организмов были идентифицированы генетические маркеры резистентности. Было показано, что фермент, известный как нечувствительная к кислороду нитроредуктаза, является ферментом, активирующим MTZ, в Helicobacter pylori и Escherichia coli , и бактерии с инактивированным NTR или nsSNV в этом гене могут быть устойчивыми. 62 64 Кроме того, резистентность паразита Trichomonas vaginalis связана с SNV в двух генах нитроредуктазы ntr4Tv и ntr6Tv. 65 SNV, обнаруженные в межгенных областях 13 генов в T. vaginalis , также связаны с устойчивостью, и исследование предполагает, что панель генетических маркеров может использоваться в качестве диагностического инструмента устойчивости .66 Межгенный анализ также следует провести в Giardia , чтобы предсказать, могут ли SNV здесь играть роль в резистентности к MTZ.

Фермент в Giardia , известный как нечувствительная к кислороду нитроредуктаза (NTR-1), аналогичен NTR у бактерий, и он мог быть приобретен в результате латерального переноса от бактерий. 48 NTR-1 отличается от NR-1 и NR-2 из-за отсутствия доменов ферредоксина в белке и может не играть ключевую роль в переносе электронов кластера Fe-S. В нашем анализе мы обнаружили, что присутствие nsSNV в NTR-1 низкое. Неизвестно, играет ли этот фермент роль в активации MTZ у Giardia , но он может играть фундаментальную роль в защите от окислительного и нитрозативного стресса, поскольку он нечувствителен к O 2 и, как было показано, активируется во время Экспозиция МТЗ. 15

Giardia также потенциально может подавлять ферменты, детоксицирующие кислород, чтобы защитить себя от активированной формы MTZ. Это подавление является благоприятным из-за того, что MTZ может снижаться только в микроаэрофильной или анаэробной среде. Присутствие кислорода помогает деактивировать MTZ путем бесполезного цикла, создавая АФК. 60 Затем АФК потребуется обширная детоксикация ферментами антиоксидантной системы, чтобы избежать вредного повреждения клеток. 67 В наборе B Giardia высокая вариабельность была обнаружена в двух белках, детоксицирующих кислород, НАДН-оксидазе (GSB_9719), в то время как предполагаемый фермент НАДФН-оксидоредуктаза (GSB_17150), способствующий АФК, имел более высокую вариабельность, чем в среднем для обоих наборов. Ранее было показано, что оксидоредуктазы активируются при заражении Giardia H 2 O 2. 37 Функции и характеристики НАДФН-оксидоредуктаз и их потенциальных паралогов следует изучить в будущих исследованиях, чтобы понять, играют роль в устойчивости к MTZ, поскольку оксидоредуктазы с нулевыми мутациями, вызывающие нефункциональные белки, были связаны с устойчивостью к MTZ у 90–256 H. пилори . 68

Было обнаружено, что некоторые из генов, исследованных в настоящем исследовании, имеют мало или вообще отсутствуют nsSNV (Fd6 и гистон h3A в наборе B, в дополнение к 10 генам в наборе A2, см. Таблицу S2). Изменения в этих законсервированных генах потенциально могут иметь более серьезные последствия и влиять на биологические функции, такие как выживаемость в культуре, клиническая инфекционность и толерантность к свободным радикалам, и это может стать темой для изучения в будущих исследованиях культивируемых и некультивируемых изолятов.

Резистентность, индуцированная в лаборатории, может иметь другие проявления, чем клиническая резистентность, и использование изолятов Giardia непосредственно от пациентов без лабораторного культивирования, вероятно, дополнит исследования с изогенными лабораторными штаммами. 69 , 70

Некодирующие области

SNV, обнаруженные в не-CDS областях генов, могут воздействовать на регуляторные элементы и промоторы, что может в дальнейшем влиять на транскрипцию генов, трансляцию мРНК и следующую экспрессию белка. 35 , 71 В нашем исследовании было обнаружено, что гены NR-1 и кофактора PFOR Fd2 имеют особенно большое количество пре-CDS SNV в сборке B Giardia . Последовательность, предшествующая CDS, содержит промоторы транскрипции, и, основываясь на скудных знаниях о них в Giardia , они представляют собой короткие, длиной около 50 п.н., подобные инициатору AT-богатые последовательности примерно от -65 до -29 пар оснований выше начала ATG. кодон. 57 , 72 Ранее сообщалось, что низкая консервативность промоторов в Giardia является обычным явлением и может быть связана с нашими выводами. 72 Однако пока неизвестно, как присутствие SNV в промоторных областях генов Giardia может повлиять на транскрипцию генов. Таким образом, интерпретация результатов SNV в этих регионах ограничена, и в этом исследовании мы решили представить их, но не оценивать их потенциальную регулирующую роль.

Домены ферредоксина и SNV

Выравнивание NR и Fd в этом исследовании включает только домены ферредоксина, ответственные за связывание кластеров Fe-S (см. ).Эта область ранее была связана с активацией лекарственного средства, поскольку считается, что электроны переносятся из домена ферредоксина в активный восстановительный центр для восстановления MTZ. 18 Активный восстановительный центр в NR ранее был охарактеризован как домен редуктазы нитрофлавинмононуклеотида (FMN). 18

Большинство nsSNV, присутствующих в выравнивании доменов ферредоксина, вероятно, не изменят функцию белков, поскольку изменения не изменяют основные свойства, например, полярность или заряд аминокислотных остатков.

Некоторые другие изменения расположены вблизи цистеиновой части мотива связывания 4Fe-4S и поэтому могут влиять на геометрию или свойства электронного переноса кластера Fe-S. Ранее предполагалось, что активированный MTZ способен реагировать с нуклеотидами и цистеинами (свободными тиоловыми группами) и образовывать аддукты. 38 Может ли MTZ образовывать аддукты с белками, исследованными в настоящем исследовании, и могут ли аминокислотные замены, близкие к цистеиновым доменам, влиять на образование, необходимо дополнительно изучить с помощью исследований структурной и молекулярной биологии.

Другие белки, которые также имеют отдельные домены Fd, включают два больших белка PFOR-1 и PFOR-2. Было высказано предположение, что у них есть три мотива для связывания кластера 4FeS4. Даже если PFOR имеют свои собственные домены Fd, считается, что они все еще используют Fd в цитозоле для переноса электронов и активации MTZ. 38

Покрытие и множественные копии генов

Было обнаружено, что несколько генов в этом исследовании имеют паралоги, аннотированные в геномах Giardia сборки A2 и B, и мы стремились включить гены, присутствующие в обоих Giardia сборки.Всего было найдено 12 паралогов НАДФН-оксидоредуктазы, и было проведено сопоставление для сравнения их сходства (данные не показаны). Выравнивание показало, что они были похожи друг на друга только на 78,3% и, вероятно, не являлись многокопийными генами.

Мы не смогли исследовать истинное количество sSNV и nsSNV последовательности гена флавогемопротеина из-за его вариабельно более высокого охвата, чем у других генов, что указывает на то, что он присутствует в различном количестве копий в разных изолятах (таблица S1) .SNV, возможно, могут быть комбинацией SNV всех присутствующих аллелей гена флавогемопротеина, а не истинных SNV одного гена.

Два более коротких паралога флавогемопротеина, DHA2_153759 и DHA2_152971, были идентифицированы и имели высокую идентичность более длинному флавогемопротеину DHA2_154000 (данные не показаны). Функции этих двух белков должны быть подробно исследованы в будущем, чтобы узнать, имеют ли они сходные свойства с DHA2_154000, или они потенциально могут быть ошибочно аннотированными или фрагментированными версиями DHA2_154000.Более короткие флавогемопротеины могли повлиять на охват изолятов Giardia сборки A2, поскольку каждый из них будет соответствовать 5′- или 3′-концу гена DHA2_154000. Они не перекрываются, оставляя ок. 500 п.н. в середине гена. Тем не менее покрытие было равномерным, и два паралога в сборке A2 также не объясняли бы более высокое покрытие гена сборки B GSB_151570. Возможные вариации числа копий в этом гене в сочетании с изменяющимися аминокислотами SNV могут быть важны для понимания способности Giardia справляться с окислительным стрессом, поскольку флавогемопротеин является важным ферментом, очищающим NO и O 2 . 16 , , , , , 36 , , 97 , 73 76

Мы также отметили, что гистон H3A было в 24 разах, чем в среднем в 24 раза один из изолятов группы А2. Возможно, этот ген мог отсутствовать или быть обнаружен в другом контиге в этом изоляте, или могла произойти ошибка секвенирования.

Ограничения WGS

Используемая в нашем исследовании технология секвенирования парных концов Illumina MiSeq дала низкий охват нескольких изолятов и их генов, что ограничивает анализ SNV. Для двух наборов B и одного набора изолятов A2 средний охват генов составил всего 11,3–14,0 (таблица S1). Низкий охват снижает вероятность обнаружения SNV с низкой распространенностью, поскольку пороговое значение охвата было установлено на >10. Кроме того, короткие чтения размером 2×300 п.н. препятствовали идентификации полноразмерных гаплотипов генов в нашем исследовании. Относительно грубые эталонные геномы, используемые в этом анализе, также могут потенциально затруднить анализ SNV, поскольку изоляты Giardia , использованные для получения эталонных геномов, выращивались в культуре в течение десятилетий и все еще состоят из нескольких сотен контигов вместо предсказанных пяти хромосом. .

%PDF-1.6 % 522 0 объект > эндообъект внешняя ссылка 522 95 0000000016 00000 н 0000005867 00000 н 0000005949 00000 н 0000006077 00000 н 0000006945 00000 н 0000007074 00000 н 0000007203 00000 н 0000007333 00000 н 0000007539 00000 н 0000007668 00000 н 0000008071 00000 н 0000008437 00000 н 0000009007 00000 н 0000009680 00000 н 0000010330 00000 н 0000010704 00000 н 0000011070 00000 н 0000011640 00000 н 0000011962 00000 н 0000012550 00000 н 0000012854 00000 н 0000013009 00000 н 0000013659 00000 н 0000014033 00000 н 0000014069 00000 н 0000017491 00000 н 0000022212 00000 н 0000027010 00000 н 0000031752 00000 н 0000035888 00000 н 0000040081 00000 н 0000044912 00000 н 0000049038 00000 н 0000070752 00000 н 0000073401 00000 н 0000083642 00000 н 0000084698 00000 н 0000084894 00000 н 0000085073 00000 н 0000089508 00000 н 0000089741 00000 н 0000089810 00000 н 00000

00000 н 00000

00000 н 00000 00000 н 0000094063 00000 н 0000094293 00000 н 0000094362 00000 н 0000094644 00000 н 0000094670 00000 н 0000095104 00000 н 0000097856 00000 н 0000098093 00000 н 0000098162 00000 н 0000098415 00000 н 0000098441 00000 н 0000098853 00000 н 0000103174 00000 н 0000103440 00000 н 0000103748 00000 н 0000105927 00000 н 0000106157 00000 н 0000106226 00000 н 0000106435 00000 н 0000106461 00000 н 0000106846 00000 н 0000128585 00000 н 0000128837 00000 н 0000129248 00000 н 0000131844 00000 н 0000132096 00000 н 0000132179 00000 н 0000134511 00000 н 0000134763 00000 н 0000138576 00000 н 0000138826 00000 н 0000139288 00000 н 0000144642 00000 н 0000144894 00000 н 0000147734 00000 н 0000147990 00000 н 0000148078 00000 н 0000150641 00000 н 0000150897 00000 н 0000153574 00000 н 0000153830 00000 н 0000154111 00000 н 0000154363 00000 н 0000155837 00000 н 0000157492 00000 н 0000158966 00000 н 0000161946 00000 н 0000163605 00000 н 0000163718 00000 н 0000002196 00000 н трейлер ]>> startxref 0 %%EOF 616 0 объект>поток xYgTYҋPUb(“**ET*(*k[uE$4PTa5B\laö~ʮ|s$ٟvep疷

прзедние завесение.

pdf – pajero II 2.8 i inne – borysek17

Wykorzystujemy pliki cookies i podobne technologie w celu usprawnienia korzystania z serwisu Chomikuj.pl oraz wyświetlenia reklam dopasowanych do Twoich potrzeb.

Jeśli nie zmienisz ustawień dotyczących cookies w Twojej przeglądarce, wyrażasz zgodę ich umieszczanie na Twoim komputerze przez administratora serwisu Chomikuj.pl – Kelo Corporation.

W każdej chwili możesz zmienić swoje ustawienia dotyczące cookies w swojej przeglądarce internetowej. Dowiedz się więcej w naszej Polityce Prywatności – http://chomikuj.pl/PolitykaPrywatnosci.aspx.

Jednocześnie informujemy że zmiana ustawień przeglądarki może spowodować ograniczenie korzystania ze strony Chomikuj.pl.

W przypadku braku twojej zgody na akceptację cookies niestety prosimy o opuszczenie serwisu chomikuj. пл.

Wykorzystanie plików cookies przez Zaufanych Partnerów (достосование рекламы до Twoich potrzeb, анализ skuteczności działań marketingowych).

Wyrażam sprzeciw na cookies Zaufanych Partnerów
НИЕ ТАК

Wyrażenie sprzeciwu spowoduje, że wyświetlana Ci reklama nie bedzie dopasowana do Twoich preferencesji, a będzie to reklama wyświetlona przypadkowo.

Istnieje możliwość zmiany ustawień przeglądarki internetowej w sposób uniemożliwiający przechowywanie plików cookies na urządzeniu koncowym. Można również usunąć pliki cookies, dokonując odpowiednich zmian w ustawieniach przeglądarki internetowej.