Кпп 1221: Доступ ограничен: проблема с IP

Содержание

Полезная информация | ТД «ТехСтройИнвест»

Коробка передач МТЗ-1221. Особенности, схема и ремонт

Коробка передач является одним из наиболее важных узлов любого транспортного средства. Именно КПП отвечает за изменение направления и скорости движения. Для трактора с его высоким расходом горючего и значительной нагрузкой на силовую установку правильный выбор программы позволяет не только снизить потребление топлива, но и способствует продлению срока службы узлов и агрегатов.

Чтобы эксплуатировать КПП в оптимальном режиме, своевременно выявлять неисправности и осуществлять ремонт, необходимо представлять схему расположения отдельных элементов и принципы функционирования узла.

Устройство коробки МТЗ-1221

Коробка передач – механическое ступенчатое 6-диапазонное устройство с шестернями постоянного зацепления. Имеет 4 режима переднего хода и 2 режима заднего. Поддерживает возможность переключения 4 скоростей внутри каждого диапазона при помощи специальных синхронизаторов.

В результате КПП обеспечивает включение 16 передних и 8 задних режимов движения.

Коробка передач трактора МТЗ включает следующие узлы:

  • механизм управления;
  • узел передач;
  • блок шестерен;
  • вторичный вал;
  • вал заднего хода и пониженных передач;
  • гидросистему;
  • корпус, в котором расположены вышеуказанные элементы.

Коробка передач МТЗ-1221: схема переключения

В тракторе «Беларус» управляющий механизм КПП состоит из двух компонентов: блок переключения передач с синхронизаторами и устройство переключения диапазонов. Каждый из указанных узлов имеет свой отдельный рычаг управления в кабине трактора.

Соответственно, при включении нужной скорости вначале устанавливается в требуемое положение рычаг включения передачи, а затем рычаг выбора диапазонов.

 

Схема переключения режимов работы КПП представлена на фото, расположенном на сайте.

Римскими цифрами обозначены положения рычага включения передач, арабскими – рычага выбора диапазонов.

Неисправности коробки передач МТЗ-1221

КПП трактора является надежным износостойким устройством, способным прослужить более трех лет в режиме ежедневной эксплуатации до проведения первичного ремонта.

Для этого необходимо соблюдать соответствующий режим работы самого узла и сопряженных с ним элементов. На исправность коробки передач оказывают влияние следующие факторы:

  • достаточность уровня масла и соответствующее давление;
  • своевременность очистки центрифуги и фильтрующих элементов;
  • соблюдение режима регулировки сцепления;
  • состояние переднего ведущего моста;
  • правильность регулировки зацепления ГП заднего моста (для полноприводных моделей).

Ремонт КПП МТЗ-1221

Первый этап ремонта – демонтаж коробки передач, полная разборка и мойка узлов и агрегатов. Дальнейшие действия зависят от характера поломки.

Наиболее характерные неисправности и причины их возникновения:

  • недовключение передач – износ компонентов верхней крышки КПП;
  • повреждение или повышенный износ шестерен первичного вала – пониженное давление масла или неисправность сцепления;
  • повреждение подшипников или срыв гайки вторичного вала – неправильная регулировка зацепления ГП.

КПП МТЗ-1221: схема переключения

Для удобства водителя схема переключения расположена возле соответствующего рычага (см. фото на нашем сайте).

Нужно учитывать, что во избежание повышенного износа деталей КПП включение скоростей производится последовательно. Переключение в пределах диапазона на ходу допустимо только при движении по ровной дороге. В условиях бездорожья рекомендуется преодолевать подобные участки на заранее выбранном режиме.

Коробка передач (КПП) Беларус-1221 -Схема трактора МТЗ 1221

Коробка переключения – это главный узел в транспортном средстве. Она отвечает за скорость движения, изменение направления.

Устройство

Коробка передач представляет собой ступенчатое устройство механического типа, которое предполагает 6 диапазонов и имеет шестерни постоянного зацепления. Передний ход представлен 4 режимами, а задний – двумя. Есть возможность переключать скорости в каждом диапазоне, для этого предлагаются отдельные синхронизаторы. В коробке передач есть такие узлы, как корпус, гидросистема, вторичный вал, вал заднего хода, блок с шестернями, узел передач, механизм управления.

Трактор «Беларус» имеет коробку переключения, которая содержит 2 компонента. Первый – блок, с помощью которого переключаются передачи с синхронизаторами. Второй – устройство, переключающее диапазоны. Узлы обладают собственными рычагами управления. Когда запускается нужная скорость, сначала рычаг устанавливается в нужное положение, после уже используют рычаг для выбора диапазона.

Возможные неисправности

КПП трактора – это устройство, отличающееся износостойкостью и надежностью. Трансмиссия может служить на протяжении 3 лет и при этом работать каждый день. Чтобы ремонт не пришлось делать раньше, нужно соблюдать правильный режим работы всех элементов, узлов. Важно помнить, что на функциональность КПП трактора влияют разные факторы:

  • количество масла, давление;
  • чистка элементов для фильтрации, центрифуги. Ее нужно проводить вовремя;
  • соблюдение режима, согласно которому регулируется сцепление;
  • состояние ведущего моста, расположенного впереди;
  • правильность регулировки зацепления.

Как производится ремонт

При необходимости выполнить ремонтные работы обычно весь процесс начинается с демонтажа КПП, разборки агрегатов, узлов и их чистки. Последующие действия будут зависеть от поломки и ее характера. Если говорить о наиболее распространенных поломках, то это:

  • невозможность полноценного включения передачи. Причиной может стать износ элементов крышки коробки передач, расположенной сверху;
  • повреждение шестерен, которые относятся к первичному валу, либо их износ. К этой неисправности может привести недостаточное давление масла либо неправильное сцепление;
  • срыв гаек, повреждение подшипников. Причина – неправильно отрегулировано зацепление ГП.

Если восстановить работоспособность агрегата не удалось, в таком случае следует купить коробку передач (КПП) Беларус-1221 и произвести ее монтаж на СТО.

04.06.2012 ,5624 Просмотров.

Коробка передач трактора МТЗ-1221

________________________________________________________________________

Коробка передач КПП трактора МТЗ-1221

Коробка передач МТЗ-1221 – механическая ступенчатая с шестернями постоянного зацепления, диапазонная (4 диапазона переднего хода и 2 диапазона заднего хода) с переключением передач внутри диапазонов с помощью синхронизаторов. Обеспечивает 16 передач переднего хода и 8 передач заднего хода, а также привод переднего ведущего моста и привод синхронного ВОМ.

Устройство коробки передач МТЗ-1221

КПП МТЗ-1221 состоит из узла передач; вала пониженных передач и заднего хода; блока шестерен; вторичного вала; механизма управления; гидросистемы; корпуса коробки передач.
Узел передач состоит из первичного вала (1) со свободно установленными на подшипниках (9) и (74) шестернями (3, 8, 11, 14). На шлицах вала размещены две шлицевые втулки (5), на которых установлены конические инерционные синхронизаторы (7). Вал монтируется на подшипниках (2) и (29).

Коробка передач МТЗ-1221

1 — вал первичный; 2, 29, 33, 27, 38, 39, 40, 49, 58, 35, 70, 77 — подшипники; 3, 8, 11, 14, 20, 23, 24, 37, 45, 50, 54, 56, 57, 63, 65, 66, 69 — шестерни; 4, 26, 62, 73 — стаканы; 5, 44, 48, 55, 64, 68, 19, 32, 52 — втулки; 6 — корпус; 7 — синхронизатор; 9, 36, 51, 74 — игольчатые подшипники; 10 — вилка; 12, 16 — поводки; 13 — корпус вилок; 15 — болт; 17 — шарик; 18— пружина; 21— полумуфта; 22, 53, 34 — зубчатые муфты; 25, 31 — прокладки регулировочные; 28 — вал вторичный; 30, 47, 59, 71, 75 — гайки; 41 — вал блока шестерен; 42 — шестерня синхронного ВОМ; 43— кольцо стопорное; 46 — вал пониженных передач; 61 — трубопровод; 67 — промежуточный вал; 76— втулка подвода смазки; 78 — вилка.

На промежуточный вал (67), установленный в корпусе КПП МТЗ-1221 на двух подшипниках (35) и (70), посажены с небольшим натягом ведомые шестерни (63), (65), (66), (69). Пакет шестерен с подшипниками затянут на валу гайкой (71). Вал пониженных передач и заднего хода установлен в корпусе коробки на подшипниках (49) и (58). На нем установлены шестерня (54) первого и второго диапазонов, шестерня (50) — заднего хода.

На шлицах вала расположена втулка (55) с наружными и внутренними шлицами и установленной на ней шестерней (56) ходоуменьшителя. Ведомая шестерня (57) установлена на валу на бронзовой втулке. При отсутствии ходоуменьшителя шестерня (57) соединена с валом шлицами шестерни (56), зафиксированной в этом положении стопорным кольцом на втулке (55). В валу выполнены осевое и радиальные сверления для подвода смазки к подшипникам 51 и втулке шестерни 57.

На валу (41) блока шестерен КПП МТЗ-1221 на шлицах установлены шестерни (37) и (44).

Этот вал смонтирован на подшипниках (77), (39) и (40). Задняя опора вала расположена в
ступице шестерни (42) привода синхронного ВОМ и переднего ведущего моста на двух роликовых подшипниках (39) и (40). Шестерня (42) установлена в корпусе на подшипнике (38).

Вторичный вал (28), выполненный за одно целое с ведущей конической шестерней, установлен в корпусе на конических подшипниках (27) и (33). На валу неподвижно посажены ведущая шестерня (24) привода переднего ведущего моста, на ступице которой установлена на подшипнике (36) ведомая шестерня (23), полумуфта (21), втулка (19), с установленной на ней ведомой шестерней (20). Втулка (19) с посаженным на ней подшипником удерживается от проворота стопором. Пакет деталей на валу затянут гайкой (30). В валу выполнено осевое и радиальное сверления для смазки подшипников (36) и (27).

Механизм управления коробки передач МТЗ-1221

Механизм управления КПП МТЗ-1221 состоит из механизма переключения передач с синхронизаторами и механизма переключения диапазонов. Механизм переключения передач смонтирован в крышке (9) и корпусе вилок (13). В крышке (9) установлены: вилка (16а), рычаг (11а), поводок (19) и рычаг (8а), закрепленный болтом и шпонкой на поводке (19). В корпусе вилок (13) установлены поводки (12, 16), на которых закреплены вилки (10). Для предотвращения одновременного включения двух диапазонов установлены шарики (17).

Механизм управления коробки передач МТЗ-1221

1 — ограничитель; 2 — шпонка; 3 — шарик; 4 — гайка; 5 — болт; 6 — пружина; 7 — втулка; 8, 8а — рычаг; 9 — крышка; 10 — корпус; 11, 11а — рычаг; 12 — палец; 13 — пружина; 14 —
сфера; 15 — чехол; 16, 16а — вилка; 17 — крышка; 18 — палец; 19, 20 — поводки, 21 — кулиса.

Механизм переключения диапазонов КПП МТЗ-1221 состоит из вилки (16), рычага (11), поводка (20) и рычагов (8), установленных в крышке (9), и деталей, установленных в корпусе коробки передач. Зубчатые муфты (22, 53, 34) перемещаются закрепленными на поводках вилками (вилка (78), другие детали на рисунке не показаны). Положение зубчатых муфт (22, 53, 34) в нейтральном и во включенном положениях фиксируются деталями (6, 7а, 11). Для предотвращения одновременного включения зубчатых муфт (34) и (53) в отверстиях корпуса коробки передач установлены блокирующие шарики (6).

Механизм переключения высшей и низшей ступеней редуктора коробки передач смонтирован на крышке механизма переключения и состоит из цилиндра (11), закреплённого на оси (12), шпильки (7), рычага (5), закреплённого на валике (4). Вилка (16) соединяется с рычагом (5) с помощью пальца (6). Рычаг валика (4) входит в зацепление с поводком вилки (18) и при повороте валика перемещает муфту синхронизатора (26). Положение рычага (5) регулируется изменением длины шпильки (7) с последующим контрением гайкой (8). Подключение цилиндра (11) к гидравлической системе производится клапаном злектрогидравлическим (14).

Механизм переключения высшей и низшей ступеней редуктора коробки передач МТЗ-1221

1 — вилка переключения передач; 2 — вилка переключения диапазонов; 3 — болт; 4 — валик; 5 — рычаг; 6 — палец; 7 — шпилька; 8 — контргайка; 9, 13 — маслопроводы; 10 — датчик давления; 11— цилиндр гидравлический; 12 — ось; 14 — клапан электрогидравлический; 15 — датчик; 16 — вилка; 17 — кронштейн; 18 — винт регулировочный.

Датчик (15) подключает клапан (14) к электрической сети только при нейтральном положении рычага переключения передач. Втянутое положение штока цилиндра (11) соответствует низшей «L» ступени редуктора. Датчики (10) служат для индексации включения ступеней редуктора. Для регулировки цилиндра (11) переместить поршень внутрь цилиндра до упора. Повернуть рычаг (5) против хода часовой стрелки, включив понижающий диапазон редуктора коробки передач. Ввернуть шпильку (7) на 8 – 9 оборотов, законтрить гайкой (8).

Вворачивая или выворачивая вилку (16), совместить отверстия в рычаге (5) и вилке (16), законтрить гайкой. Повернуть рычаг (5) по ходу часовой стрелки, включив повышающий диапазон редуктора коробки передач. Выдвинуть шток цилиндра (11), совместить отверстия в рычаге (5) и вилке (16). Рычаг (5) и вилку (16) соединить пальцем, установить шайбу и шплинт. Вворачивая или выворачивая болт (18), упереть сферическую часть болта в рычаг (5), законтрить гайкой.

Система управления редуктором КПП МТЗ-1221

Электрогидравлическая система управления редуктором КПП МТЗ-1221 состоит из панели управления (1), расположенной в кабине трактора справа от водителя, рычага (3)
переключения передач и ступеней редуктора, датчика (5) нейтрали, датчиков (7) и (8), установленных на гидроцилиндре переключения редуктора, электрогидрораспределителя (6),
расположенного сверху на крышке КПП, соединительных кабелей (4) с колодками (9).

Система запитана от бортовой электросети через блок предохранителей (2). Электрическое питание подается в систему до пуска двигателя. На рукоятке рычага управления редуктором
(3) расположены кнопки (10, 11) и сигнализаторы (светодиоды) (13,12) включения низшей и высшей ступеней редуктора, соответственно. На панели (1) расположены сигнализаторы
(15 и 14) включения низшей и высшей ступеней редуктора и реле управления редуктором.

Система управления редуктором КПП МТЗ-1221

1 — панель управления, 2 — блок предохранителей, 3 — рычаг переключения передач и ступеней редуктора; 4 — соединительные кабели, 5 — датчик нейтрали КПП, 6 — электрогидрораспределитель редуктора; 7 — датчик давления высшей ступени, 8 — датчик давления низшей ступени, 9 — колодки соединительные; 10 — кнопка включения низшей ступени; 11 — кнопка включения высшей ступени; 12 — светодиод сигнализации высшей ступени; 13 — светодиод сигнализации низшей ступени; 14, 15 — контрольные лампы.

Сигналы на сигнализаторы (13, 12) и (15, 14) подаются от соответствующих датчиков давления (8 и 7). После запуска двигателя в исходном состоянии включена низшая ступеньредуктора. При этом должны гореть сигнализаторы (13 и 15). Переключение на высшую ступень редуктора КПП МТЗ-1221 должно происходить при нажатии на кнопку (11). При этом сигнализаторы (13 и 15) должны погаснуть, а сигнализаторы (12 и 14) – загореться. Переключение с высшей ступени на низшую осуществляется при нажатии на кнопку (10).

 

________________________________________________________________________

________________________________________________________________________

________________________________________________________________________

Группа 17 Коробка передач. Подгруппа 1701. КПП 112-1700010-А-10. Вал вторичный. МТЗ-1221

  • Главная
  •  / 
  • Группа 17 Коробка передач. Подгруппа 1701. КПП 112-1700010-А-10. Вал вторичный. МТЗ-1221

Используется в Каталогах

Состав узла

№ на рис

Наименование

Артикул

Кол-во

Наличие

Примечание

0

85-2403014-В

1

2

(80-1701252-В + 50-2403021-В)

4

80-1701256 Кольцо

80-1701256

1

5

80-1701254 Втулка

80-1701254

1

6

80-1701354 Шайба

80-1701354

1

9

Болт М12-6gх25 ГОСТ 7796-70

М12-6gх25.88.35.019 ГОСТ 7796-

1

12

85-1702048 Штифт

85-1702048

1

13

Шарик 10,0-60 ГОСТ 3722-81

10,0-60 ГОСТ 3722-81

1

16

Проволока 1,6-О-С ГОСТ 3282-74

1,6-О-С ГОСТ 3282-74

1

19

80-1701348 Втулка

80-1701348

1

23

Шайба 10 ОТ

10 ОТ ОСТ 37. 001.115-75

4

24

Болт М10-6gх30 ГОСТ 7796-70

М10-6gх30.88.35.019 ГОСТ 7796-

4

27

50-1701258 Прокладка регулировочная осевого зазора подшипников вторичного вала коробки передач 0,2 мм

50-1701258

6

28

50-1701259 Прокладка регулировочная зазора подшипников вторичного вала коробки передач 0,5 мм

50-1701259

4



© 2008 – 2022 ЗАО “Беларусь-МТЗ”.
Правила использования материалов сайта.

Какие страны принимают беженцев из Украины

Попасть в Польшу можно на своем автомобиле. Раньше нужно было обязательно иметь полис страхования – «Зеленую карту». Без полиса в страну не пускали, но 28 февраля стало известно, что границы Польши, Словакии и Венгрии граждане Украины могут пересекать без полисов «Зеленая карта». Такое решение поддержала Молдова. Украинские пограничники также не требуют наличия полиса «Зеленая карта». Для других стран – полис понадобится.

Уже из западных областей по железной дороге можно добраться до Польской Республики. Польская железная дорога разрешила украинцам бесплатно пользоваться поездами категории TLK и IC до 25 марта. Для этого при посадке достаточно показать документ, удостоверяющий личность.

Отметим, что на границе с Польшей километровые очереди и своей очереди можно ожидать несколько суток.

С 25 февраля во всех автомобильных пунктах пропуска на границе с Польшей во Львовской области, а также в пункте пропуска «Устилуг» на Волыни осуществляется пропуск лиц, пересекающих границу пешком. До этого пешее пересечение границы было возможно только в пункте пропуска «Шегини».

Все пункты пропуска на польско-украинской границе по ссылке.

На правительственном сайте Республики Польша отмечено, что попасть в страну можно даже без загранпаспорта. Но в таком случае следует подать заявление о международной защите на польской границе. Важно иметь с собой другой документ, удостоверяющий личность, и при опросе на границе объяснить, что вы хотите подать заявление на получение статуса беженца в Польше. Также необходимо будет объяснить, почему вы убегаете из Украины.

По прибытии в Польшу украинцы могут воспользоваться помощью, которую предлагает польское правительство. Следует обратиться в один из перечисленных ниже пунктов приема граждан. В этих пунктах можно получить питание, возможность отдыха и необходимую информацию.

Адреса пунктов приема украинских граждан:

  • Pałac Suchodolskich Gminny Ośrodek Kultury и Turystyki, ul. Parkowa 5, 22-175 Dorohusk;
  • Przygraniczne Centrum Kultury и Rekreacji, ул. Spółdzielcza 8, 22 – 540 Dołhobyczów;
  • Zespół Szkół w Horodle, ул. Piłsudskiego 58, 22 – 523 Horodło;
  • Szkoła Podstawowa в Lubyczy Królewskiej (zaplecze hali sportowej), ул. Jana III Sobieskiego 5, 22 – 680 Lubycza Królewska;
  • Świetlica, Korczowa 155 37-552 Korczowa;
  • Hala sportowa – Medyka 285, 37-732 Medyka;
  • Szkoła Podstawowa w m. Krowica Sama 183, 37-625 Krowica Sama;
  • Była Szkoła Podstawowa w Łodynie, Łodyna 41, 38-700 Ustrzyki Dolne

От границы в Польше автобусный перевозчик Flixbus бесплатно перевозит беженцев. Рейс курсирует от Перемышля и Жешува и развозит людей по территории Польши. Получить бесплатный билет можно на вокзале в Перемышле у работника компании, одетого в фирменную зеленую куртку с логотипом «Flixbus». Также можно получить онлайн билет. Для этого необходимо отправить запрос на электронную почту [email protected] с темой письма «Украина». В тексте письма следует указать город отправления (Перемышль или Жешув) и место назначения, свое имя и фамилию, номер телефона и адрес электронной почты, на которую придет билет.

На сайте www.ukrainesupport.net собраны предложения жилья для лиц, выезжающих из Украины из-за военных действий. Там можно узнать доступные варианты жилья во всех регионах Польши. В каждом предложении указано, сколько людей можно разместить, а также пригодно ли это жилье для детей или исключительно для взрослых.

Контрольно-пропускные пункты

DUI: что нужно знать

При приближении к контрольно-пропускному пункту должно быть сделано много предупреждений. Это часто проявляется в виде знаков, огней, конусов безопасности, сигнальных ракет, а также присутствия офицеров в форме и патрульных машин с мигающими фарами. Офицеры, работающие на контрольно-пропускных пунктах, часто отделяют часть дороги, заставляя движение сливаться в одну или две полосы. Следует отметить, что вы не обязаны проходить через контрольно-пропускной пункт. Перед входом в контрольно-пропускной пункт будет путь эвакуации.Решение не проезжать через контрольно-пропускной пункт не является основанием для остановки. Однако, если вы нарушите правила дорожного движения, избегая остановки, вас могут привлечь к ответственности за нарушение и допросить об употреблении алкоголя и наркотиков.

Процесс полицейской проверки

Офицеры, работающие на контрольно-пропускном пункте, должны следовать схеме остановки транспортных средств. Должна быть установлена ​​частота. Если решат проверить каждого водителя, то нужно остановить каждое транспортное средство. Если они проверяют каждого третьего водителя, они должны остановить каждое третье транспортное средство и пропустить остальных.Только супервайзер может определить, нужно ли изменить шаблон. Если движение начинает дублироваться или возникает другая проблема, то в это время супервайзер может изменить схему остановки транспортных средств. Прежде чем добраться до офицера, вам придется договориться о наборе конусов, чтобы проверить свои навыки вождения. Если вас выбрали для остановки, офицер должен проинформировать вас о цели остановки. Вас могут попросить предъявить лицензию и регистрацию, которые вы обязаны предоставить по закону. Ожидайте, что вас спросят, употребляли ли вы алкоголь или какие-либо контролируемые вещества в тот день.Если вы ответите «нет» и у офицера нет других причин задерживать вас или ваш автомобиль, вам должно быть разрешено пройти через контрольно-пропускной пункт. Если вы ответите «да», вас спросят, сколько наркотиков или алкоголя вы употребляли и когда в последний раз употребляли. Офицер может принять решение о дальнейшем расследовании в зависимости от ваших ответов на эти вопросы. Офицер также будет осматривать вас на признаки опьянения. Если полицейский захочет более подробно изучить вашу ситуацию, он направит вас в сторону от дорожного движения.В противном случае вы свободны. Ниже приведен список улик, на которые офицер будет смотреть, чтобы решить, задерживать ли вас.

  • Запах алкоголя или наркотиков
  • Контейнеры для алкоголя или принадлежности для наркотиков
  • Налитые кровью глаза
  • Невнятная речь
  • Неловкие пальцы
  • Медленная реакция
  • Непоследовательные ответы на вопросы
  • Проблемы с предоставлением лицензии и регистрации.

Если офицер заподозрит, что вы находитесь в состоянии опьянения или под кайфом на основании этого обмена, вас попросят выйти из машины для дальнейшего расследования.

Checkpoint Consulting LLC в Бирмингеме, Мичиган

Checkpoint Consulting LLC — это компания с ограниченной ответственностью (LLC), расположенная по адресу 1221 Bowers St. # 2399 в Бирмингеме, штат Мичиган, которая в мае 2020 года получила ссуду PPP, связанную с коронавирусом, от SBA в размере 95 000,00 долларов США .

$ Информация о кредите ГЧП

Кредит № 3926867710

Checkpoint Consulting LLC в Бирмингеме, штат Мичиган, получила ссуду для защиты зарплаты в размере 95 000 долларов США через Wells Fargo Bank, Национальная ассоциация, которая была одобрена в мае 2020 года.

Статус этого кредита сообщается SBA как «Полностью выплаченный», что включает как погашенные кредиты, так и кредиты, полностью освобожденные от погашения в соответствии с руководящими принципами PPP. Статус кредита последний раз обновлялся SBA в апреле 2021 года.

Оценка заработной платы на основе формулы приемлемости кредита SBA PPP
Понимание формулы SBA для определения права на получение кредита PPP

Самый простой способ описать стандартный расчет ППС состоит в том, что предприятия имеют право на получение максимального кредита ППС до 2. 5 x среднемесячная заработная плата за 2019 год составляет . Однако конкретные методы расчета различаются в зависимости от типа объекта и имеют многочисленные ограничения.

Подробнее
  • Для большинства корпораций и некоммерческих организаций «расходы на заработную плату» включают валовую заработную плату и чаевые, оплачиваемые работодателем медицинские страховки и пенсионные взносы, а также некоторые налоги на заработную плату.
  • Для самозанятых лиц и индивидуальных предпринимателей сумма ППС основана на Приложении C (либо валовой доход, либо чистая прибыль в зависимости от ситуации, плюс валовая заработная плата и т. д., если помимо владельца есть другие работники)
  • Во всех случаях заработная плата или чистая прибыль свыше 100 000 долларов США ограничены 100 000 долларов США для целей расчета ППС.
  • Для новых предприятий, не действовавших в 2019 году, доступны альтернативные учетные периоды

Пожалуйста, ознакомьтесь с последними официальными правилами расчета PPP SBA для полного объяснения методов расчета суммы кредита PPP.

Понимание оценок заработной платы на основе суммы ППС

Обратите внимание, что расчеты заработной платы основаны на упрощенной формуле приемлемости PPP и не учитывают такие факторы, как заработная плата свыше 100 000 долларов США и другие компоненты приемлемости PPP.

Подробнее

Для ООО «Чекпойнт Консалтинг» расчет, используемый для оценки затрат на заработную плату, показан ниже:

(95 000 долл. США / 2,5) * 12 = 456 000 долл. США

Могут существовать ситуации, в которых может быть неточной оценка расходов на заработную плату получателя PPP на основе суммы полученного кредита PPP.Эта оценка предполагает, что получатель PPP подал заявку на получение полной суммы, на которую он имел право, и никакие другие переменные не повлияли на полученную сумму кредита.

  • Поскольку заработная плата для целей участия в PPP ограничена 100 тысячами долларов, предприятия с высокооплачиваемыми сотрудниками будут давать заниженную оценку фактических затрат на заработную плату.
  • Кроме того, поскольку этот стандартный расчет основан на максимальной приемлемости кредита, он будет недооценивать расходы на заработную плату, если компания не подала заявку на получение полной суммы кредита, на который она имела право, исходя из расходов на заработную плату в 2019 году и других описанных переменных. над.

Обратите внимание: информация о расчетной заработной плате и компенсациях на основе правил PPP предоставляется только в информационных целях.

Основываясь на стандартной формуле приемлемости PPP, можно оценить расходы на заработную плату, представленные компанией в ее заявке PPP (подробности см. выше). Чтобы соответствовать полученной сумме кредита PPP, расходы Checkpoint Consulting LLC на заработную плату в 2019 году оцениваются как минимум в 456 000 долларов США .

Исходя из того, что они сообщили о сохранении 6 рабочих мест, это равняется предполагаемой средней годовой компенсации в размере 76 000 долларов США на одного работника 1

Сообщено об использовании доходов PPP:

В заявлении о ГЧП ООО «Чекпойнт Консалтинг» сообщило о намерении использовать средства, полученные по кредиту ГЧП, на следующие расходы:

Деловая информация – Checkpoint Consulting LLC в Бирмингеме, MI

Похожие компании рядом с Бирмингем

В районе Бирмингема 2 предприятия отрасли «Прочие консультационные услуги по вопросам управления» получили кредит ГЧП. Эти местные предприятия сообщили в среднем о 4 сотрудниках (по сравнению с 6 сотрудниками этой компании) и получили средний кредит PPP в размере 63 232 долларов США (по сравнению с 95 000 долларов США) этой компании.

Отраслевая сравнительная статистика по ППС

По всей стране 82 222 предприятия в отрасли «Другие управленческие консультационные услуги» получили в общей сложности 3,7 млрд долларов кредитов ГЧП. Эта отрасль в целом получила менее 1% от общего объема распределенного финансирования ГЧП.

Получатели PPP в этой отрасли сообщают о среднем 4 сотрудника , На 33% ниже , чем Checkpoint Consulting LLC сообщила о 6 сотрудниках и получила в среднем кредит PPP в размере 44 991 долларов США, что на 53% ниже , чем кредит этой компании в размере 95 000 долларов США.

Уэст-Палм-Бич Адвокат по уголовным делам

Я адвокат Уильям Валлшайн, и моя юридическая фирма округа Палм-Бич стремится обеспечить превосходное юридическое представительство. У меня более 34 лет опыта работы, в том числе пять лет работы прокурором в округе Палм-Бич, и я полностью привержен защите прав своих клиентов.

Очень важно, чтобы вы поговорили с адвокатом по уголовным делам Уэст-Палм-Бич , как только вы узнаете, что находитесь под следствием, или сразу после ареста. Самостоятельное решение вопросов может негативно сказаться на исходе вашей ситуации. Позвоните мне сегодня по телефону 561-533-1221 или свяжитесь с моей юридической фирмой округа Палм-Бич онлайн, чтобы назначить бесплатную начальную консультацию.

Уголовная защита Уэст-Палм-Бич

Флорида имеет одни из самых строгих наказаний за уголовные преступления в стране.От насильственных преступлений до обвинений в хранении оружия тысячи флоридцев обвиняются и осуждаются, не имея реального шанса защитить себя. Суды невероятно перегружены, что делает невозможным рассмотрение дела каждого подсудимого перед коллегами. Чтобы удержать подсудимых от передачи своих дел в суд и позволить им доказать свою невиновность, прокуроры нагромождают обвинения, зная, что подсудимые, скорее всего, сдадутся и пойдут на сделку о признании вины для смягчения приговора. Здесь, в адвокатской конторе Уильяма Валлшайна, мы считаем, что каждый заслуживает справедливого отношения и права рассказать свою точку зрения.Хотя мы стараемся уберечь наших клиентов от длительных и напряженных судебных процессов, мы готовы защищать ваши права в суде, если это необходимо. Мы защищаем клиентов по всем нижеперечисленным видам правонарушений.

Типы уголовных дел, которые мы берем на себя

  • Беловоротничковые преступления — Беловоротничковые преступления охватывают все ненасильственные правонарушения, совершаемые с целью получения денежной выгоды. По данным Huffington Post, растраты, мошенничество, кража личных данных и вымогательство, а также финансовые схемы — это лишь несколько примеров беловоротничковой преступности, которая растет с 2004 года.
  • Насильственное преступление/убийство — Насильственное преступление — это любое преступление, связанное с причинением физического вреда или угрозой причинения физического вреда другому лицу. Яркие примеры включают нанесение побоев, нападение, сексуальное насилие, нанесение побоев при отягчающих обстоятельствах и убийство.
  • Преступления с применением оружия/оружия — По данным World Population Review, примерно треть жителей Флориды владеют оружием. Таким образом, обвинения в оружии довольно распространены во Флориде. Обычные правонарушения, связанные с оружием, включают скрытое ношение оружия без разрешения, владение огнестрельным оружием в качестве осужденного преступника, мигалку или разрядку оружия в общественных местах, а также ношение огнестрельного оружия в частном или государственном учреждении, где огнестрельное оружие запрещено, например, в школе или в месте проведения досуга. работай.
  • Детская порнография — Владение, создание или помощь в создании детской порнографии является федеральным уголовным преступлением, если оно выходит за пределы границ штата, а в противном случае — уголовным преступлением штата. Осуждения за детскую порнографию обычно влекут за собой длительные сроки тюремного заключения и репутацию, которая может преследовать вас всю жизнь.
  • Ловушка — Если правоохранительные органы подтолкнули вас к совершению преступления, которое в противном случае вы бы не совершили, обвинения должны быть сняты. Это называется провокация, и это незаконно.
  • Устранение — В некоторых случаях возможно удаление сведений о судимости из публичного досье. Мы можем помочь вам в этом процессе, чтобы вы могли продолжить свою жизнь и оставить прошлое позади.
  • Производство большого жюри — Производство большого жюри используется в некоторых уголовных делах для определения того, было ли совершено преступление. В настоящее время важно иметь юридическое представительство.
  • Апелляции по уголовным делам — Все обвинительные приговоры могут быть обжалованы.Это нормальная часть системы уголовного правосудия, и она может дать вам второй шанс очистить свое имя, но вам нужен опытный адвокат, чтобы апелляционный суд встал на вашу сторону.
  • Конфискация активов — Правоохранительные органы имеют право налагать арест на активы, которые, по их мнению, могут быть приобретены незаконным путем. Однако конфискацией активов часто злоупотребляют, в результате чего ответчику нечем платить по счетам, ипотеке или адвокату.

Если вы ищете очень агрессивного и преданного своему делу адвоката — я ваш адвокат.Я адвокат по уголовным делам в Уэст-Палм-Бич с более чем 34-летним опытом ведения дел в системе правосудия. Я представляю клиентов в государственных и федеральных судах в округе Палм-Бич и по всей Флориде.

Уильям Валлшайн может помочь с вашей защитой по уголовным делам

Для того, чтобы снять обвинения против вас и очистить ваше имя или уменьшить наказание, вам нужен опытный адвокат по уголовным делам, который будет активно защищать вас в зале суда и вне его.Позвоните Уильяму Валлшайну сегодня по телефону 561-533-1221, чтобы записаться на бесплатную консультацию.

Расовые различия в использовании ингибиторов запрограммированной смерти-1.

3068

Предыстория: Существуют опасения по поводу расовых различий в доступе к испытаниям новых противораковых препаратов, включая ингибиторы контрольной точки запрограммированной смерти 1 (анти-PD1). Неизвестно, распространяются ли эти различия на пациентов, получавших анти-PD1, в реальной практике. Методы: Мы использовали ретроспективные данные из базы данных электронных медицинских карт Flatiron Health, которая включает более 250 онкологических клиник и 1,5 миллиона пациентов с онкологическими заболеваниями. Мы выявили пациентов с диагнозом после 1 января 2011 г., которым проводилась системная терапия по поводу распространенного немелкоклеточного рака легкого (нМРЛ; n = 13 473), метастатического почечно-клеточного рака (мПКР; n = 1537) и распространенной меланомы (n = 1221). . В каждой когорте мы определили тип лечения (анти-PD1 против не-анти-PD1).Терапевтические линии, содержащие исследуемые препараты, были исключены. Мы использовали логистическую регрессию для моделирования использования анти-PD1 в зависимости от расы с поправкой на такие факторы, как возраст, пол, стадия постановки диагноза и линия терапии. Результаты: Из 16 231 пациента в нашей выборке 4 643 (28,6%) получали анти-PD1 препараты. Расовое распределение отличалось у пациентов, получавших анти-PD1, по сравнению с пациентами, не получавшими анти-PD1, в когорте с НМРЛ (таблица: p < 0,01), но не в когорте mRCC (p = 0,84) или когорте с прогрессирующей меланомой (p = 0). .96). В двумерном анализе пациентов с НМРЛ лечение анти-PD1 было связано с другой расой, мужским полом, стадией II на момент постановки диагноза, плоскоклеточной гистологией, курением в анамнезе и линией терапии (все р < 0,05). Скорректированные модели показали отсутствие существенных различий в вероятности получения анти-PD1 при сравнении чернокожих и белых пациентов, получавших системную терапию по поводу НМРЛ (aOR для черных и белых: 0,86, 95% ДИ 0,72–1,02), mRCC (aOR 0,90, 95). % ДИ 0,53-1,49) или меланому (aOR 2,02, 95% ДИ 0.42-14.59). Выводы: Среди пациентов, проходящих системную терапию в крупной национальной сети онкологических клиник, мы не обнаружили существенных расовых различий в использовании анти-PD1.


P-значение MRCC
P-значение
Melanoma
Melanoma
P-значение
Anti-PD1 Anti-Pd1 -PD1 Не анти-PD1 Анти-PD1 Не анти-PD1
Гонка 9 <. 01 0,84 0,96
Белый,% 66,8 62,8 67,9 65,0 78,6 78,8
черный,% 70249 7 8.1 6.5 6.5 7.2 0.8 0. 5
азиатский,% 3.1 3.4 1.3 1,7 0,3 0,2
Другое,% 9,2 10,3 12,4 12,6 6,2 6,9
Неизвестный,% 13,5 15.4 11. 9 13.9 13.6 14.2 13.6 13.6
9002 9002

Мейотическая сеть контрольно-пропускной точки: пошаговые через Meiotic Prophase

Аннотация

Генерация гаплоидных гамет путем мейоза является высококонсервативным процессом для организмов, размножающихся половым путем, который почти во всех случаях включает обширный разрыв хромосом.Эти разрывы хромосом происходят во время мейотической профазы и необходимы для мейотической рекомбинации, а также для последующего расхождения гомологичных хромосом. Однако их формирование и восстановление должны тщательно контролироваться и согласовываться с ядерной динамикой и программой клеточного деления, чтобы избежать создания аберрантные хромосомы и дефектные гаметы. Становится все более очевидным, что сложная сигнальная сеть контрольно-пропускных пунктов связанный с канонической реакцией на повреждение ДНК, глубоко переплетен с мейотической программой и сохраняет порядок во время мейотического процесса. профаза.Эта сеть мейотических контрольных точек (MCN) создает широкий спектр зависимых отношений, контролирующих движение хромосом. спаривание хромосом, структура хроматина и репарация двухцепочечных разрывов (DSB). В этом обзоре мы суммируем наше текущее понимание МКС. Мы обсуждаем общие черты и различия в различных экспериментальных системах, уделяя особое внимание новые принципы проектирования, которые контролируют и ограничивают перекрестные помехи между сигналами, чтобы в конечном итоге обеспечить достоверное наследование хромосом к следующему поколению.

Мейоз — это специализированный процесс сегрегации хромосом, при котором диплоидная родительская клетка дает начало гаплоидным гаметам (Kleckner 1996; Petronczki et al. 2003; Gerton and Hawley 2005). Снижение плоидности необходимо для гаметогенеза у всех организмов, размножающихся половым путем, и достигается за счет одного цикл репликации ДНК, за которым следуют два события сегрегации хромосом, которые однозначно разделяют не только сестринские хроматиды но и гомологичных хромосом.Расхождение гомологичных хромосом происходит во время первого деления мейоза (мейоз I), с последующим разделением сестринских хроматид во время мейоза II.

Механика сегрегации хромосом требует, чтобы пары хромосом, которые должны быть сегрегированы, сначала были соединены с друг друга, чтобы обеспечить их правильную ориентацию на шпинделе (Miller et al. 2013). Так же, как и во время митоза, мейотические сестринские хроматиды удерживаются вместе за счет сцепления сестринских хроматид, которое устанавливается когда диплоидный геном дуплицируется во время премейотической S-фазы (рис. 1А). Однако для гомологичных хромосом такого априорного сцепления не существует. Следовательно, главная механистическая проблема мейоза заключается в выявлении гомологичных пар хромосом и установлении связей между ними. Большая часть мейотической профазы, расширенная G 2 фаза, предшествующая мейозу I, посвящена достижению этой цели.

Фигура 1.

Кроссовер устанавливает физическую связь между гомологичными хромосомами.( A ) Схема пары гомологичных хромосом (красная и пурпурная). Реплицированные сестринские хроматиды удерживаются вместе за счет когезии. (зеленые кольца). ( B ) Кроссовер между гомологичными хромосомами в сочетании со слипчивостью дистальнее места кроссинговера устанавливает физическое связь между ними. ( C ) Кроссовер позволяет гомологичным хромосомам правильно ориентироваться в мейотическом веретене (серые линии).

У большинства организмов связи между гомологичными хромосомами устанавливаются путем перекрестной рекомбинации (рис.1Б). Кроссоверы обмениваются ковалентными связями между последовательностями гомологичных хромосом, а в сочетании с кроссинговер-дистальными сплоченность сестринских хроматид, обеспечивают физические связи, необходимые для гомологичного расхождения хромосом во время мейоза I (рис. 1C) (ван Хемст и Хейтинг, 2000; Ли и Орр-Уивер, 2001). Кроссоверная рекомбинация инициируется после премейотической репликации ДНК с запрограммированным введением многочисленных ДНК. DSB консервативным ферментом SPO11 (рис.2А) (Кини, 2001). Удаление SPO11 и 5′-резекция концов DSB дает 3′-концы одноцепочечной ДНК (оцДНК), которые используются для инвазии цепи. белки RAD51 и DMC1 для поиска гомологичных матриц репарации (Neale and Keeney 2006). В мейозе создается отчетливое межгомологическое (IH) смещение, способствующее перекрестной рекомбинации между гомологичными хромосомами. а не сестринские хроматиды (Hollingsworth 2010; Lao and Hunter 2010). Более того, процесс, известный как перекрестная интерференция, обеспечивает равномерное распределение перекрестов до стабильного проникновения нити. взаимодействия с гомологом (Carpenter and Sandler 1974; Bishop and Zickler 2004; Berchowitz and Copenhaver 2010).Только стабилизированные интермедиаты вторжения нити превращаются в двойные соединения Холлидея и в конечном итоге разрешаются как кроссоверы. тогда как оставшиеся интермедиаты вытесняются из гомолога для репарации как некроссоверы (Allers and Lichten 2001; Hunter and Kleckner 2001).

Фигура 2.

Репликация мейотической ДНК и репарация DSB происходят одновременно со структурными морфогенами хромосом. Схема ДНК метаболизм ( A ) и события хромосомной организации ( B ) во время мейотической профазы. Гомологичные хромосомы реплицируются во время премейотической S-фазы. При лептонеме инициируются DSB, тогда как теломеры хромосом прикрепляются к ядерной оболочке, а мейотические хромосомы принимают букет конформация (у большинства организмов). Считается, что синапсис (обозначенный серыми линиями) между гомологичными парами хромосом инициирует в местах перекрестной репарации при зигонеме.При пахинеме гомологичные хромосомы полностью синапсированы, а перекрест обозначен. ремонт находится на промежуточной стадии развязки двойного Холлидея. Синаптонемный комплекс разбирается при диплонеме, обнажая сайты кроссинговера между гомологичными хромосомами.

Формированию и репарации DSB способствуют изменения структуры хромосом, которые легко наблюдаются цитологически и лежат в основе цитологически определяемые стадии профазы мейоза — лептонема, зигонема, пахинема и диплонема (рис. 2B) (Baarends and Grootegoed 2003; Storlazzi et al. 2003). Мейотический морфогенез хромосом инициируется одновременно с репликацией ДНК со сборкой белковой хромосомы. оси, которые дают каждой хромосоме палочковидный центр с исходящими хроматиновыми петлями (Klein et al. 1999; Blat et al. 2002; Panizza et al. 2011; Borde and de Massy 2013). Организация оси петли завершена в лептонеме и важна для формирования DSB, а также для установления IH. предвзятость (Блат и др.2002 г.; Сторлацци и др. 2003 г.; Карбалло и др. 2008 г.; Ким и др. 2010 г.; Хонг и др. 2013). По мере прохождения клеток через зигонему гомологичные хромосомы спариваются, их оси выравниваются, и у многих организмов хромосомы прогрессивный синапс. Синапсис относится к сборке трехчастного белкового каркаса, называемого синаптонемным комплексом. (SC), который образован центральными поперечными филаментами, расположенными между парными осями гомологичных хромосом (Page and Hawley 2004; Fraune et al. 2012). Предполагается, что DSB, которые должны стать кроссоверами, являются сайтами инициации синапсов, в дополнение к инициация синапсов на центромерах у некоторых организмов (Klein et al. 1999; Henderson and Keeney 2004; Tsubouchi and Roeder 2005; Obeso and Dawson 2010; Subramanian and Hochwagen 2011). Заключительные стадии перекрестной рекомбинации происходят в контексте SC. Когда все хромосомы достигают полного синапса, клетки находятся в пахинеме.К последующей диплонеме клетки завершили репарацию и разборку своих СК по мере того, как они подготовиться к расхождению гомологичных хромосом.

Наряду с этими хромосомными переходами часто обнаруживается, что ядерная организация претерпевает заметные изменения (Fig. 2B). Специфическая реструктуризация ядра различается у разных организмов и может принимать форму кластеризации теломер в ядре. оболочки (стадия «букета», наблюдаемая у многих организмов), субнуклеарную конгрессию хромосом, как у Caenorhabditis elegans и Drosophila melanogaster , или сильное удлинение ядра, как у Tetrahymena thermophila (Scherthan 2001). ; Шихан и Павловски, 2009 г.; Такео и др.2011 г.; Таннети и др. 2011 г.; Лойдл и др. 2012 г.; Воглар и Янч, 2013). Кроме того, хромосомы часто претерпевают периоды чрезвычайной динамики, примером чего является «движение конского хвоста» в Schizosaccharomyces pombe и быстрое пахитенное перемещение Saccharomyces cerevisiae или кукурузы (Ding et al. 1998; Tomita and Cooper 2006; Koszul et al. 2009; Sheehan and Pawlowski 2009; Sonntag Brown et al. 2011; 2012). Эти процессы обычно происходят в зависимости от стадии, и в большинстве случаев считается, что они либо помогают хромосоме, спаривание или разрешение непродуктивных хромосомных взаимодействий (Koszul and Kleckner 2009).

Работа, проведенная за последние несколько лет, показала, что мейотические клетки полагаются на сложную сеть сигнальных механизмов для координации эту сложную программу и создают зависимости между различными процессами (Roeder and Bailis 2000; Hochwagen and Amon 2006; Longhese et al. 2009; MacQueen and Hochwagen 2011). Эти зависимости необходимы для установления правильного времени событий профазы мейоза и во избежание вредных взаимодействий. между разными процессами.Они также дают возможность задерживать или даже отбраковывать мейотические клетки, если мейотические процессы останавливаются. криво. Здесь мы попытаемся обобщить наше текущее понимание этой сети зависимостей. Стремясь упростить, мы будут ссылаться на компоненты контрольных точек их человеческими гомологами, где это возможно, и указывать номенклатуру, специфичную для организма. в надстрочном индексе при ссылке на функцию в контексте, специфичном для организма.

СЕТЬ ЗАВИСИМОСТЕЙ СОЗДАЕТ ПОРЯДОК В МЕЙОТИЧЕСКОЙ ПРОФАЗЕ

В этом обзоре мы называем общую сигнальную сеть, включающую эти механизмы, сетью мейотических контрольных точек. (МКН).В соответствии с первоначальным определением контрольных точек клеточного цикла (Hartwell and Weinert, 1989) мы используем термин «механизм контрольных точек» для описания любого сигнального механизма, который создает зависимую связь между метаболически независимые мейотические процессы (например, образование DSB и сборка SC). Это широкое определение призвано подчеркнуть что контрольно-пропускные пункты не являются в первую очередь механизмами наблюдения, которые реагируют на аномальные события. Хотя мейотические DSB представляют собой форму повреждения генома, их образование является неотъемлемой частью каждой профазы мейоза и, таким образом, само по себе не является аномальным.Как следствие, мы рассматриваем MCN не просто как сеть реагирования на ущерб, но как неотъемлемый координирующий механизм, занимающий центральное место в упорядоченной выполнение мейотической профазы.

На рис. 3 представлен общий обзор нашего текущего понимания MCN. Безусловно, большинство зависимостей возникает из-за формирования DSB, по-видимому, отражая неотъемлемую опасность, связанную с поломкой хромосом.Однако некоторые процессы также связаны с завершением репликации ДНК или правильным спариванием и синапсом хромосом. Примечательно, что почти все в настоящее время известные зависимости в профазе мейоза включают активность консервативных PI3-подобных киназ ATM и ATR. Это означает, что MCN должен иметь механизмы для различения сигналов, чтобы вызвать соответствующие ответы. Мы обсуждаем это важное функции MCN в следующей части этого обзора, но сначала сосредоточимся на общей архитектуре MCN.

Рисунок 3.

Зависимые отношения, установленные MCN. Сеть мейотических контрольных точек создает сеть зависимостей для продвижения последовательного прогрессирование мейотических событий ( A ) или предотвращение мейотического прогрессирования в условиях дефекта репарации или синапсов ( B ). Пунктирные линии и стрелки указывают на модуляцию активности.

ГЛАВНЫЕ ИГРОКИ

Основной сигнальный механизм MCN использует многих участников канонической сети ответа на повреждение ДНК (DDR) (Table 1), включая консервативные сенсорные киназы контрольных точек ATM и ATR (MacQueen and Hochwagen 2011). ATM и ATR являются эволюционно родственными серин/треонинкиназами, которые активируются различными формами повреждения ДНК. а также асинапсом во время мейоза (Carballo and Cha 2007; Burgoyne et al. 2009). ATM реагирует в первую очередь на тупые и конъюгированные с белком концы DSB, тогда как ATR активируется одноцепочечной ДНК, покрытой RPA, что приводит к от процессинга DSB, а также соединений оцДНК/дцДНК (Harrison and Haber 2006; Lovejoy and Cortez 2009). Обе киназы полагаются на активность кофакторов для распознавания повреждений. Банкомат обнаруживает тупые концы с помощью MRN комплекс (MRE11-RAD50-NBS1) (Усуи и др., 2001; Накада и др., 2003; Ю и др., 2005). ATR обнаруживает оцДНК через свой активатор ATRIP, а соединения оцДНК/дцДНК через PCNA-подобный комплекс 9-1-1 (RAD9-RAD1-HUS1) (Zou and Elledge 2003; Harrison and Haber 2006; Refolio et al.2011). Кроме того, кофакторы BRCA1 и TOPBP1 способствуют активности ATR в ответ на несинапсированный мейотический хроматин (Refolio et al. 2011; Royo et al. 2013). ATM и ATR фосфорилируют большие и часто перекрывающиеся наборы субстратов серин-глутамина (SQ) или треонина-глутамина. (TQ) дипептиды. Многие из известных эффекторов MCN являются прямыми мишенями ATM/ATR (таблица 2), создавая непосредственную связь между сигналом и результатом. Кроме того, ATM/ATR активируют эффекторные киназы CHK1 и CHK2, которые дополнительно передают сигналы контрольной точки, но обычно контролируют более ограниченный набор процессов.

Таблица 1.

Белки MCN и их гомологи

Таблица 2.

События фосфорилирования, участвующие в создании зависимостей

КОНТРОЛЬ ФОРМИРОВАНИЯ DSB

Текущая репликация блокирует формирование DSB

Первым известным механизмом контрольной точки в профазе мейоза является контрольная точка мейотической репликации. Как и в митотических клетках, первичная функцией контрольной точки мейотической репликации является поддержание потенциала репликации, что происходит через ATR- и CHK2-зависимая стабилизация репликационных вилок (Branzei and Foiani 2010; Blitzblau and Hochwagen 2013). Однако, кроме того, контрольная точка мейотической репликации также предотвращает образование DSB, пока репликация продолжается. (Рис. 3 и 4A) (Тонами и др., 2005; Огино и Масаи, 2006; Блицблау и Хохваген, 2013).Принудительное временное разделение репликации и формирования DSB важно, потому что оно гарантирует, что только кроссинговеры образуются между реплицированными хромосомами (см. рис. 1). Более того, он предотвращает летальные конфликты между образованием DSB и репликацией ДНК (Blitzblau and Hochwagen 2013). Контрольные точки репликации S. pombe и S. cerevisiae подавляют DSB посредством репрессии транскрипции основных регуляторов образования DSB, хотя идентичность конечных цель контрольной точки различается между двумя дрожжами. У S. pombe экспрессия Mde2, связанного с осью регулятора DSB, подавляется контрольной точкой, тогда как экспрессия самого SPO11 находится под контролем контрольной точки репликации у почкующихся дрожжей (Ogino and Masai 2006; Miyoshi et al. 2012; Blitzblau and Hochwagen 2013). Кроме того, контрольная точка репликации S. cerevisiae также непосредственно контролирует хромосомную локализацию и активацию других компонентов аппарата DSB (MER2 и REC114).Передача сигналов в этом случае происходит как посредством CHK2 Rad53 -зависимых, так и независимых механизмов и включает регуляцию консервативной киназы клеточного цикла DDK (Blitzblau and Hochwagen 2013). Роль CHK2 в координации премейотической репликации ДНК и последующего входа в мейотическую профазу также была предложена для C. elegans (MacQueen and Villeneuve 2001). Возможная даже более ранняя мейотическая роль ATR и CHK2 в репликации ДНК недавно была предложена у S. помбе . В этом организме мутация ATR/ATM- и SPO11 Rec12 -зависимого сайта фосфорилирования на CHK2 Mek1 приводила к задержке репликации ДНК (Tougan et al. 2010). Хотя это событие фосфорилирования может представлять собой обратную регуляцию репликации с помощью DSB, эта возможность требует дальнейшее исследование показало, что делеция ATR Rad3 или CHK2 Mek1 аналогичным образом не влияла на прогрессирование S-фазы (Ogino and Masai 2006).

Рисунок 4.

Сеть мейотических контрольных точек интегрирует сигнал в соответствующий ответ. ( A ) Остановленные репликационные вилки предотвращают образование DSB с помощью нескольких механизмов у S. cerevisiae . Mec1 регулирует транскрипцию SPO11 и рекрутирование Rec114 на мейотические хромосомы, тогда как расположенная ниже киназа Rad53 контролирует фосфорилирование Mer2. регулируя активность киназы DDK. ( B ) MCN регулирует резекцию.И киназы Tel1, и Mec1 активируют Sae2 для резекции конца DSB с образованием выступов 3′ ssDNA. MCN также предотвращает гиперрезекцию концов разрыва. ( C ) Киназы Mec1/Tel1 способствуют смещению IH посредством фосфорилирования Hop1, что, в свою очередь, приводит к рекрутированию, димеризации и активации киназы Mek1. Регуляция активности Rad54 с помощью Mek1 ингибирует репарацию IS, тем самым способствуя смещению IH. ( D ) У Drosophila MCN негативно регулирует киназу NHK-1.Киназа NHK-1 контролирует конденсацию хроматина ооцита, а также позволяет его освобождение от ядерной оболочки по завершении ремонта ДШБ. ( E ) Несинапсированный хроматин у мышей рекрутирует ATR через HORMAD1/2. ATR способствует фосфорилированию h3AFX, которое распространяется в хроматин образует петли и рекрутирует факторы молчания. ( F ) MCN регулирует выход из мейотической профазы, контролируя экспрессию и локализацию фактора транскрипции Ndt80 как а также путем ингибирования киназы CDK.Киназа Cdc5 снимает ингибирование Ndt80 MCN в петле прямой связи, что позволяет быстро выход из профазы.

Уровни DSB — Баланс

В дополнение к связи образования DSB с достаточным завершением репликации ДНК появляется все больше свидетельств того, что MCN также обеспечивает обратную связь для модуляции уровней DSB после начала формирования DSB.У мышей и Drosophila потеря ATM приводит к увеличению количества маркеров DSB, в то время как потеря ATR вызывает сходные фенотипы у A. thaliana , что свидетельствует о том, что DSB-зависимая активация этих киназ подавляет дальнейшее образование DSB (Joyce et al. и др., 2011; Ланге и др., 2011; Курцбауэр и др., 2012). Уровни мейотических DSB должны строго контролироваться, так как чрезмерная нагрузка DSB может привести к серьезным проблемам в репарации ДНК (Johnson et al. 2007). Действительно, количество мейотических фенотипов у мышей Atm -/- можно уменьшить, уменьшив число копий SPO11 (Bellani et al.2005 г.; Барчи и др. 2008). Конкретная функция ATM в этом контексте может заключаться в предотвращении повторного образования DSB в одном и том же хромосомном локусе (включая сестринская хроматида). Пространственная близость DSB может объяснить, почему у мышей Atm -/- наблюдается сильное увеличение количества комплексов SPO11-олигонуклеотид после расщепления, но лишь умеренное увеличение количество цитологически различимых очагов RAD51 (Barchi et al. , 2008; Lange et al.2011). Анализы рекомбинантных хроматид из тетрад S. cerevisiae в специфических сайтах DSB у мутантов, лишенных ATM Tel1 или ATR Mec1 , также подтверждают эту модель (Zhang et al. 2011). Хотя мишень ATM в этом контексте еще предстоит определить, недавние эксперименты на S. cerevisiae позволяют предположить, что консервативный вспомогательный фактор SPO11 REC114 является многообещающим кандидатом. REC114 является субстратом ATM Tel1 и ATR Mec1 , и мутации, имитирующие конститутивное ATM/ATR-зависимое фосфорилирование, вызывают заметное снижение уровней DSB (Carballo et al.2013). CHK2-зависимая регуляция регуляторов DSB DSB-1 и DSB-2 может иметь эквивалентную функцию у C. elegans (Rosu et al. 2013; Stamper et al. 2013).

Ряд недавних исследований S. cerevisiae показывает, что дефекты репарации DSB дополнительно модулируют уровни DSB. Эффекты довольно сложны, поскольку MCN демонстрирует как DSB-стимулирующие и эффекты подавления DSB в зависимости от количества сформированных DSB, типа дефекта репарации и способности клеток для преждевременного выхода из профазы (Argunhan et al.2013; Блицблау и Хохваген 2013; Карбалло и др. 2013; Грей и др. 2013; Лао и др. 2013; Рокмилл и др. 2013). Наконец, работа на дрожжах и мышах также предполагает обратную связь между образованием DSB и взаимодействием гомологов, поскольку образование DSB продолжается на несинапсированных хромосомах (Kauppi et al. 2013a,b; Thacker et al. 2014).

КОНТРОЛЬ РЕМОНТА ДСБ

Активация завершения обработки DSB

Само формирование

DSB запускает основную активацию MCN (рис. 3). Одним из первых событий, следующих за образованием мейотических DSB, является инициируемая MRN/CtIP резекция конца, которая способствует гомологичному рекомбинации, а также создает барьер для подверженных ошибкам механизмов восстановления соединения концов (Joyce et al. 2012; Yin and Smolikove 2013). Резекция начинается с MRE11-зависимых эндонуклеолитических разрезов вблизи DSB, за которыми следует двунаправленная резекция, которая требуются как MRN, так и EXO1 (Захариевич и др., 2010; Гарсия и др., 2011). В С.cerevisiae , комплекс MRN Xrs2 обнаруживает необработанные мейотические концы DSB и активирует киназу ATM Tel1 , которая, в свою очередь, фосфорилирует MRN-взаимодействующий белок CtIP Sae2 , чтобы инициировать резекцию DSB (рис. 4B) (Usui et al. 2001; Картахена-Лирола и др., 2006; Терасава и др., 2008). В петле положительной обратной связи резецированные концы ДНК приводят к активации ATR Mec1 , что дополнительно способствует активации CtIP Sae2 . Однако эта зависимость не является строго линейной, поскольку ATR Mec1 также активируется независимо от ATM Tel1 , и этого достаточно для фосфорилирования CtIP Sae2 и инициации резекции (Cartagena-Lirola et al.2008).

Мейотическая резекция изначально ограничена, но если репарация DSB заблокирована, мейотические клетки вступают в фазу гиперрезекции DSB. Интересно, ATR , Mec1 и комплекс 9-1-1 также необходимы для сдерживания гиперрезекции (Shinohara et al., 2003; Gray et al., 2013; Clerici et al., 2014). Учитывая, что в процесс резекции вовлечен ряд нуклеаз (Mimitou, Symington, 2009; Zakaryevich et al.2010 г.; Гарсия и др. 2011 г.; Шецляйн и др. 2013), привлекательная модель заключается в том, что MCN обеспечивает соответствующую частоту резекций за счет активации некоторых нуклеаз, в то время как (временно) подавляя другие (Сегурадо и Диффли, 2008; Манфрини и др. , 2010; Луо и др., 2013; Суке и др., 2013). У S. cerevisiae резекция с помощью BLM Sgs1 /DNA2, в частности, вероятно, активируется только в конце мейоза (Manfrini et al. 2010; Zakharyevich et al. 2010).

Подавление межсестринской рекомбинации

Для мейотических DSB, поддерживающих образование кроссинговера между гомологичными хромосомами, выполните репарацию из более доступных гомологичных хромосом. последовательности сестринской хроматиды должны быть подавлены.Несколько механизмов действуют согласованно для достижения этой цели, как путем подавления сестринской активности RAD51-рекомбиназы и продвижения гомолога в качестве предпочтительного шаблона восстановления (Kim et al. 2010; Lao and Hunter 2010; Kurzbauer et al. 2012; Hong et al. 2013; Lao et al. 2013; Liu et al. 2014). Исследования ряда организмов указывают на центральную роль MCN в установлении смещения мейотических гомологов (Carballo et al. 2008; Latypov et al. 2010), хотя детали механизма лучше всего изучены у S.cerevisiae (рис. 4С). В этом организме ATM Tel1 /ATR Mec1 фосфорилирует HORMA-домен-содержащий белок хромосомной оси HORMAD Hop1 , гомолог HORMAD1/2 млекопитающих, на нескольких сгруппированных участках S/TQ (таблица 1) (Carballo et al. др. 2008). Это приводит к рекрутированию, димеризации и активации CHK2-подобной эффекторной киназы CHK2 Mek1 (Niu et al. 2005, 2007; Carballo et al. 2008; Wu et al. 2010), связывание которой, в свою очередь, стабилизирует метка фосфорилирования на HORMAD Hop1 (Chuang et al.2012). После активации киназа CHK2 Mek1 способствует смещению IH, возможно, частично путем фосфорилирования и ингибирования RAD54, АТФазы семейства SWI/SNF, которая стимулирует Активность RAD51-рекомбиназы для репарации сестринской хроматиды (Niu et al. 2009). Однако генетические эксперименты предполагают, что другие (в настоящее время неизвестные) мишени CHK2 Mek1 обеспечивают первичный механизм, способствующий предвзятости IH (Niu et al. 2009; Terentyev et al. 2010). Исследование S. cerevisiae и S.pombe идентифицировал несколько дополнительных мишеней CHK2 Mek1 , включая хроматиновую метку (гистон h4 T11), родственный RAD54 дрожжевой белок Rdh54 и резольвазу MUS81 (Govin et al. 2010; Tougan et al. 2010). До сих пор только Rdh54 был исключен как вероятная функциональная мишень MCN (Niu et al. 2009). Примечательно, что фосфорилирование Rdh54 во время вегетативного роста участвует в адаптации контрольных точек (Ferrari et al. 2013).

Подавление эктопической рекомбинации

Имеются данные о том, что MCN также защищает стабильность генома, предотвращая неаллельную (эктопическую) рекомбинацию. Мутанты растение Arabidopsis thaliana , лишенное как ATM, так и ATR, демонстрирует DSB-зависимые ассоциации между негомологичными хромосомами, которые сохраняются в метафазе I, наводит на мысль об эктопической перекрестной рекомбинации (Culligan and Britt 2008). Более того, усиленная эктопическая рекомбинация также наблюдается у клеток S. cerevisiae , лишенных функционального комплекса 9-1-1, и у мышей, лишенных компонента 9-1-1 HUS1 (Grushcow et al., 1999; Thompson and Stahl, 1999; Shinohara et al.). .2003 г.; Линдакер и др. 2013а; Шинохара и Шинохара, 2013 г.). Хотя соответствующие мишени контрольных точек остаются неизвестными, сеть контрольных точек может сдерживать эктопическую рекомбинацию, координируя два конца DSB (Shinohara and Shinohara 2013), представление, подтверждаемое наблюдением, что рекомбиназы RAD51 и DMC1 часто появляются в ненормальном расположении бок о бок у мутантов комплекса 9-1-1 S. cerevisiae (Shinohara et al. 2003). Увеличение количества очагов RAD51 и DMC1 у мутантов ATR A.thaliana может отражать сходный дефект, хотя геометрия загрузки рекомбиназы, по-видимому, различается между двумя организмами (Kurzbauer et al. 2012). Возможно, что повышенная эктопическая рекомбинация ответственна за снижение уровня кроссовера, наблюдаемое в ряде случаев. мутантов контрольных точек (Shinohara et al. 2003). Однако во многих случаях мутации в факторах контрольных точек также приводят к сильной задержке восстановления DSB, что может свидетельствовать в пользу более непосредственная роль механизма мейотической контрольной точки в обеспечении мейотической рекомбинации (Shimada et al.2002 г.; Шинохара и др. 2003 г.; Перец и др. 2009 г.; Джойс и МакКим, 2010).

Формирование обязательного кроссовера и перекрестная интерференция

Наконец, есть ограниченные доказательства того, что MCN играет роль в регулировании перекрестного распределения. Несколько процессов находятся на работать над тем, чтобы каждая гомологичная пара хромосом получала кроссинговер (облигатный кроссинговер), а соседние кроссинговеры не происходят слишком близко друг к другу (перекрестная интерференция).У самцов мышей активность АТМ необходима для обязательного кроссинговера. в небольшой псевдоаутосомной области гомологии, которая позволяет спаривать X- и Y-хромосомы (Barchi et al. 2008). Кроме того, у мышей, лишенных АТМ, повышено число аутосомных кроссинговеров, что сопровождается уменьшением интерференции кроссинговера. (Барчи и др., 2008). Сходным образом у S. cerevisiae , ATM Tel1 /ATR Mec1 -зависимое фосфорилирование субъединицы Rfa2 RPA, а также компонента SC RNF212 Zip3 изменяет распределение кроссинговера в некоторых генетических интервалах (Bartrand et al. др.2006 г.; Серрентино и др. 2013), хотя общий характер этих эффектов еще предстоит определить. Дефект перекрестной интерференции также наблюдался в мутантов S. cerevisiae , у которых отсутствует фосфатаза PP4, ответственная за дефосфорилирование нескольких субстратов ATR/ATM (Falk et al. 2010). Однако механизм, с помощью которого MCN влияет на перекрестное распределение, до сих пор остается неясным.

ЯДЕРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ, СОЕДИНЕНИЕ И СИНАПС

Контрольно-пропускной пункт ядерной реструктуризации

Помимо координации репарации DSB, MCN связывает мейотическую ядерную динамику как с репликацией ДНК, так и с метаболизмом DSB.У S. cerevisiae один из первых случаев реструктуризации ядра, рассредоточение кластеров митотических теломер, связан с завершением S-фазы. (Trelles-Sticken et al. 2005a) и, по крайней мере, при некоторых обстоятельствах требует активности ATR Mec1 (Trelles-Sticken et al. 2005b). Родственная связь между S-фазой и реструктуризацией ядра может существовать у C. elegans . После S-фазы в этом организме хромосомы собираются в поляризованный ядерный серп с закрепленными теломерами. кластерами в ядерной оболочке, напоминающими стадию букета, наблюдаемую у многих организмов.Эта ядерная реорганизация требуется CHK2, но не ATM/ATR (MacQueen and Villeneuve 2001; Penkner et al. 2009). Таким образом, как в этом случае активируется CHK2, неясно. Активность CHK2 требуется для нескольких событий в этом контексте, включая обогащение белками ZIM в хромосомных центрах спаривания и фосфорилирование хромосомного якоря SUN-1 в ядерная оболочка (Филлипс и Дернбург, 2006; Пенкнер и др., 2009).Дефосфорилирование SUN-1, в свою очередь, необходимо для растворения поляризованного полумесяца, когда клетки входят в пахинему. (Пенкнер и др., 2009; Воглар и др., 2013). Зависимая от контрольной точки реструктуризация ядра в букетоподобное состояние также наблюдается у Tetrahymena , хотя этот процесс требует как образования DSB, так и ATR (Loidl and Mochizuki 2009; Loidl et al. 2012).

Одним из наиболее понятных механизмов ядерной реорганизации, зависящей от MCN, в этом контексте является высвобождение хромосом. из ядерной оболочки у дрозофилы (рис.4Д). Высвобождение хромосом происходит по завершении мейотической рекомбинации и приводит к образованию компактного кластера хромосом. называется кариосомой. Перед репарацией DSB образование кариосом предотвращается ATR Mei-41 и CHK2 Mnk -зависимым ингибированием киназы NHK-1 (Ghabrial and Schupbach 1999; Abdu et al. 2002; Lancaster et al. 2010). Одним из субстратов NHK-1 является белок ядерной оболочки BAF, который должен быть фосфорилирован для высвобождения хромосом. в ядро ​​(Lancaster et al.2007). NHK-1 также необходим для фосфорилирования гистона h3A Thr119, разборки SC и загрузки конденсина, что может дополнительно способствуют образованию кариосом (Ivanovska et al., 2005; Lancaster et al., 2010).

Спаривание хромосом и букет

Стадия букета совпадает с активным спариванием гомологичных хромосом, и с этим связана неспособность правильно спариваться с замедленным распространением хромосомного букета у многих организмов.Например, наличие лишней хромосомы распространяется стадии букета и изменяет динамику репарации в трисомных ооцитах человека (Roig et al. 2005; Robles et al. 2013). Сходным образом кластеры теломер сохраняются у дефектных по спариванию spo11 мутантов S. cerevisiae и Sordaria (Trelles-Sticken et al. 1999; Storlazzi et al. 2003). Обработка DSB также необходима для выхода из стадии букета у Tetrahymena (Loidl et al. 2012).По крайней мере, в некоторых случаях эти задержки могут зависеть от регуляции контрольных точек, поскольку у мутантов мыши отсутствует ATM или его субстрат. гистон h3AFX (ранее известный как h3AX) не может выйти из стадии букета (Fernandez-Capetillo et al. 2003; Liebe et al. 2006). Наконец, у S. cerevisiae MCN также дестабилизирует негомологичное спаривание центромер в ответ на DSB посредством ATR Mec1 -зависимого фосфорилирования центрального компонента SC SCP1 Zip1 (Falk et al.2010).

Управление инициацией Synapsis

Интересным случаем контроля мейотических контрольных точек является инициация хромосомного синапса, который связан с хромосомным спаривание или образование DSB у различных организмов. У C. elegans инициация синапсов блокируется опосредованным MCN Ser12-фосфорилированием SUN-1, белка ядерной оболочки, который устанавливает связи между концами хромосом и цитоскелетом во время мейоза.Ser12-фосфорилирование SUN-1 зависит от CHK2 и Polo-подобная киназа PLK2, но не зависит от ATM/ATR (Penkner et al. 2009; Labella et al. 2011; Woglar et al. 2013). Стирание фосфорилирования Ser12 и, следовательно, инициация синапсов требует соответствующей репарации DSB (Woglar et al. 2013), а также соответствующих парных взаимодействий между хромосомами, которые, по-видимому, контролируются зависимой от силы контрольной точкой. механизма (Penkner et al. 2009; Wynne et al.2012 г.; Рог и Дернбург, 2013). Др. механизм, по-видимому, связывает инициацию синапсов с началом формирования DSB у S. cerevisiae . В отсутствие DSB инициация синапсов на центромерах активно блокируется механизмом, включающим предполагаемую SUMO-лигазу. RNF212 Zip3 и пролинизомераза Fpr3 (MacQueen and Roeder 2009). Как передается сигнал DSB, чтобы обеспечить инициацию синапсов на центромерах в этой ситуации, остается неизвестным, хотя RNF212 Zip3 недавно стал перспективным субстратом MCN (Serrentino et al.2013).

АСИНАПСИС И ТРАНСКРИПЦИОННОЕ ЗАГЛУШЕНИЕ

В настоящее время хорошо установлено, что несинапсированные хромосомы или сегменты хромосом вызывают активацию нескольких ветвей МКС. Передача сигналов контрольной точки проявляется в мейоцитах с частичным асинапсом, включая клетки, несущие дополнительные хромосомы. или хромосомные транслокации (Mahadevaiah et al.2008 г.; Бургойн и др. 2009 г.; Гарсия-Крус и др. 2009 г.; Кузнецова и др. 2009), а также временно возникает на участках хромосом с поздним синапсом (Blanco-Rodriguez 2012). У C. elegans асинапсис связан с замедленным выходом из состояния букета (Carlton et al. 2006; Colaiacovo 2006) и может запускать апоптоз (Bhalla and Dernburg 2005).

У млекопитающих участки асинапса связаны с фосфорилированием нескольких осевых белков, включая HORMAD1 и 2 (рис.4E) (Fukuda et al. 2012; Royo et al. 2013) и приводят к рекрутированию BRCA1, ATRIP, TOPBP1 и ATR на несинапсированные оси хромосом с последующим ATR-зависимым накопление γ-h3AFX (гистон h3AFX, фосфорилированный по Ser139) (Perera et al., 2004; Turner et al., 2005; Burgoyne et al., 2009; Refolio et al., 2011). Если асинапсис сохраняется, γ-h3AFX и ATR распространяются по всему хроматину с помощью γ-h3AFX-связывающего фактора MDC1. (Ichijima et al. 2011), и запускают гетерохроматинизацию и мейотическое молчание несинапсированного хроматина (MSUC). Транскрипционное замалчивание как следствие асинапса также наблюдается у ряда немлекопитающих организмов, включая Neurospora и C. elegans (Shiu et al. 2001; Bean et al. 2004; Checchi and Engebrecht 2011). В зависимости от того, какие хромосомные области молчат, MSUC у мышей часто приводит к потере сперматоцитов, предположительно в результате истощения основных факторов выживания (Burgoyne et al. 2009; Manterola et al.2009).

MSUC тесно связан с мейотическим молчанием половых хромосом внутри полового тела путем мейотической инактивации половых хромосом. (MSCI) (рис. 5), физиологический процесс, который отвечает на неизбежный частичный асинапсис гетероморфных половых хромосом, но не привести к гибели клеток (Turner et al. 2006). Формирование полового тела происходит на поздних стадиях зигонемы и связано со второй волной образования γ-h3AFX. образование γ-h3AFX происходит двумя волнами в мейоцитах мыши. Первая волна совпадает с началом рекомбинации, зависит от АТМ и формирует очаги, которые, как считается, отмечают DSB (Mahadevaiah et al., 2001; Barchi et al., 2005; Bellani et al., 2005). Напротив, вторая волна образования γ-h3AFX зависит от ATR, маркирует оставшиеся несинапсированные хромосомы и ведет себя подобно ответу MSUC в том, что γ-h3AFX и ATR распространяются по ассоциированным хроматиновым петлям (Mahadevaiah et al.2001 г.; Тернер и др. 2005 г.; Ройо и др. 2013). Любопытно, что хотя и опосредованная сенсорной киназой повреждения ДНК ATR, вторая волна не зависит от SPO11 (Barchi et al. 2005; Bellani et al. 2005). Мы обсудим возможные альтернативные способы активации ATR далее в этом обзоре.

Рисунок 5.

Распространение мейотической хромосомы из сперматоцитов мыши при пахинеме с изображением MSCI. Пара XY проявляется как половое тело (белая стрелка) и обогащена ATR (красный). SCP3 (зеленый) отмечает оси синапсов и несинапсированные хромосомы, ДНК выделена синим цветом. (Изображение предоставлено Sarai Pacheco и Ignasi Roig.)

ПРОГРЕСС КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА, СМЕРТЬ КЛЕТОК И СВЯЗИ С РАЗВИТИЕМ

Контроль выхода профазы

Подобно реакции на повреждение митотической ДНК, активация MCN также вызывает задержку мейотической профазы, предположительно для обеспечивают достаточное время для завершения мейотической рекомбинации.Зависящая от контрольной точки профазная задержка или остановка реакции к дефектам синапсов или репарации ДНК очевидна у многих организмов (Lydall et al. 1996; Shimada et al. 2002; Hochwagen and Amon 2006; Joyce and McKim 2010; Lyndaker et al. 2013a; Woglar et al. 2013), хотя и механистическая подробности о том, как MCN влияет на механизм клеточного цикла, до сих пор в основном ограничены S. cerevisiae и S. pombe . У обоих дрожжей задержка мейотического клеточного цикла опосредована ATR-зависимой активацией и димеризацией CHK2 Mek1 (Lydall et al.1996 год; Сюй и др. 1997 год; Шимада и др. 2002 г.; Ву и др. 2010). CHK2 Mek1 действует частично за счет ингибирования циклинзависимой киназы (CDK). У S. cerevisiae киназа CHK-2 Mek1 фосфорилирует и активирует CDK-ингибирующую киназу WEE1 Swe1 (рис. 4F) (Tung et al. 2000; Acosta et al. 2011), тогда как у S. pombe , CHK2 Киназа Mek1 способствует исключению из ядра (и, таким образом, инактивации) CDK-активирующей фосфатазы CDC25 (Perez-Hidalgo et al.2008). Результатом в обоих случаях является стойкое ингибирующее тирозиновое фосфорилирование CDK. Параллельно с этим MCN S. cerevisiae также запускает ядерный экспорт Ndt80 (Hepworth et al. 1998; Wang et al. 2011), ключевого фактора транскрипции, который активирует транскрипцию большого набора генов, включая B- тип циклинов, а также киназа PLK Cdc5 , способствующая выходу из профазы (Chu and Herskowitz 1998; Sourirajan and Lichten 2008). Фосфорилирование тирозина и репрессия циклинов удерживают CDK в неактивном состоянии и, таким образом, предотвращают преждевременный выход из профазы, в то время как МКС активен.Кроме того, недавние исследования и моделирование показали, что Ndt80 и PLK Cdc5 встроены в сложную систему контуров обратной связи и прямой связи, которая создает бистабильный переключатель для быстрого выхода из мейотическая профаза после инактивации сети контрольных точек (Acosta et al. 2011; Okaz et al. 2012).

Стойкие дефекты и индукция гибели клеток

Если дефекты репарации или синапсов сохраняются, сети контрольных точек различных организмов используют разные терминальные стратегии. Клетки S. cerevisiae вступают в длительную остановку профазы, из которой можно выйти, прервав мейоз, если условия окружающей среды станут благоприятными для митотического роста (Simchen 2009). В качестве альтернативы S. cerevisiae могут адаптироваться к повреждению путем инактивации MCN и попытки мейоза (Bailis et al. 2000; Hochwagen et al. 2005; Iacovella et al. 2010). Напротив, мейоциты многоклеточных животных часто выбраковываются в результате зависимой от контрольной точки индукции апоптотической гибели клеток. программа (Гартнер и др.2000 г.; Бхалла и Дернбург, 2005 г.; Ди Джакомо и др. 2005), процесс, который также функционирует как механизм скрининга предшественников зародышевых клеток с хромосомными аномалиями (Ahmed et al. 2013; Stevens et al. 2013; Titen et al. 2014). Как и в случае реакции на повреждение митотической ДНК, решение о включении апоптотической программы в ответ на дефекты репарации требует CHK2-зависимая активация семейства белков p53 и обычно ограничивается определенными стадиями профазы мейоза. (Дерри и др.2001 г.; Барчи и др. 2005 г.; Сух и др. 2006 г.; Рутковски и др. 2011 г.; Болкун-Филас и др. 2014; Ким и Су, 2014). Роль MCN в этом решении было трудно определить, потому что в большинстве случаев потеря факторов MCN сама по себе вызывает Дефекты репарации DSB, которые, в свою очередь, вызывают гибель зародышевых клеток (Barchi et al. 2008; Burgoyne et al. 2009). И наоборот, даже относительно нижестоящий фактор в MCN, такой как p53, не только регулирует апоптоз, но также приводит к снижение образования кроссовера у Drosophila (Lu et al.2010). Однако недавно было показано, что разрушение компонента комплекса 9-1-1 HUS1 обходит как остановку пахинемы, так и апоптоз. в сперматоцитах мышей (Lyndaker et al. 2013a), а нарушение CHK2 имеет аналогичные эффекты в ооцитах мышей (Bolcun-Filas et al. 2014), подтверждая роль MCN в этом решении.

Интересно, что как у мышей, так и у C. elegans реакция мейотической гибели клеток демонстрирует выраженный половой диморфизм.Сперматоциты мыши с дефектами репарации DSB или синапсы, как правило, подвергаются гибели клеток при пахинеме, обычно в сочетании с дефектным формированием половых тел и, как следствие, аберрантная экспрессия генов. Напротив, дефектные ооциты часто проходят через мейотические деления (Nagaoka et al. 2011, 2012). Хотя многие из них позже удаляются в результате атрезии, выжившие ооциты имеют значительно более высокий уровень хромосомных аномалий. по сравнению со зрелой спермой.Причина такой неэффективности удаления аберрантных ооцитов неясна. Различный половой диморфизм наблюдается у червей. Гермафродиты C. elegans обнаруживают сильный апоптотический ответ на персистирующие мейотические дефекты (Gartner et al. 2000; Bhalla and Dernburg 2005). Напротив, самца C. elegans инициируют только ранние стадии апоптотической программы, но предотвращают активацию каспазы (Jaramillo-Lambert et al. 2010). Эта сигнальная модификация может быть связана с конститутивно асинаптической одиночной Х-хромосомой у самцов червей.Неожиданно, несмотря на то, что механизм апоптотической выбраковки активен только у гермафродитов, самцы червей с дефектами синапсов производят меньше аберрантные гаметы, что указывает на существование механизмов защиты от апоптоза у мужчин (Jaramillo-Lambert et al. 2010).

Ссылки на разработку

Альтернативой запуску гибели клеток перед лицом стойких дефектов является предотвращение образования зрелых гамет.Соответственно, у некоторых организмов MCN создает зависимость между восстановлением DSB и последующими событиями развития. Один хорошо изученный пример встречается у Drosophila , у которых репарация DSB связана с формированием паттерна развития ооцита. В этом организме персистирующие DSB приводят к ATR mei-41 и CHK2 Mnk -зависимой модификации Vasa, РНК-геликазы, необходимой для трансляции gurken мРНК и формирования дорсовентрального паттерна яичной скорлупы (Ghabrial et al.1998 год; Стаева-Виейра и др. 2003). В результате MCN может блокировать развитие ооцитов. Аналогично, наличие персистирующих DSB или дефектных синапсов также приводит к MCN-зависимому блоку программы развития спорообразования у некоторых грибов (Tung et al. 2000; Anderson et al. 2012; Guo and King 2013), в конечном итоге предотвращая передачу хромосомных дефектов следующему поколению.

АРХИТЕКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ MCN

Из этого обзора различных ветвей контрольных точек в профазе мейоза становится очевидным, что MCN сильно взаимосвязаны. но использует удивительно небольшое количество сигнальных молекул.Это вызывает ряд вопросов, в том числе вопрос о том, как некоторые из сигналы генерируются в первую очередь, как вызывается должным образом модулированный ответ и как индивидуальные зависимости разделены и объединены.

Контекст имеет значение

Все больше данных свидетельствует о том, что специализированная архитектура мейотических хромосом играет фундаментальную роль в формировании ответ МКС.У многих организмов нарушение компонентов мейотических осей хромосом, включая SYCP3 и когезины, приводит к дефекту передачи сигналов MCN (Wang and Hoog, 2006; Кузнецова и др., 2009; Callender и Hollingsworth, 2010; Lightfoot et al., 2011), хотя в некоторых случаях потеря сигнала объясняется уменьшением образования DSB (Callender and Hollingsworth). 2010). Возможно, неудивительно, что роль MCN также была описана для нескольких гистоновых метилтрансфераз (San-Segundo and Roeder 2000; Checchi and Engebrecht 2011; Lamelza and Bhalla 2012; Ontoso et al.2013a,b), которые предположительно способствуют сборке оси хромосом или вносят вклад в структурное окружение передачи сигналов MCN. Дальше поддерживая поучительную роль окружения хроматина, дифференциальных хроматиновых меток на половых хромосомах и аутосомах связаны с дифференциальной реакцией на асинапсис у C. elegans (Checchi and Engebrecht 2011; Lamelza and Bhalla 2012).

Оси хромосом, вероятно, выполняют несколько функций в контексте MCN.Они образуют платформу для связывания и фосфорилирования белков HORMAD, которые составляют ключевую часть хромосомной среды для MCN во многих организмах (Xu et al., 1997; Martinez-Perez and Villeneuve, 2005; Carballo et al. , 2008; Lin et al., 2010; Shin et al., 2010). , 2013; Даниэль и др., 2011; Кого и др., 2012a,b; Войташ и др., 2012; Ченг и др., 2013). Кроме того, компоненты оси хромосом также напрямую взаимодействуют с компонентами MCN. Например, белок Red1 оси S. cerevisiae физически связывается с комплексом 9-1-1, взаимодействие, необходимое для активности MCN (Eichinger and Jentsch 2010).Cohesin также необходим для рекрутирования комплекса 9-1-1 у C. elegans (Lightfoot et al. 2011). Кроме того, поскольку активация киназ CHK2 с помощью ATM/ATR обычно требует присутствия адаптерных белков, она было высказано предположение, что белки оси хромосом могут обеспечивать такую ​​функцию адаптера для активации MCN (Niu et al. 2005; Carballo et al. 2008; Hunter 2008; Eichinger and Jentsch 2010; Tougan et al. 2010).

Также появляется все больше свидетельств того, что последовательные динамические изменения осей мейотических хромосом играют значительную роль в активация и модуляция MCN. Большая часть этих данных получена в результате функционального анализа TRIP13 Pch3 , широко консервативной ААА + -АТФазы. TRIP13 Pch3 модулирует мейотическую структуру хромосом в различных контекстах, во многих случаях контролируя хромосомное истощение или фосфорилирование белков HORMAD (San-Segundo and Roeder 1999; Borner et al. 2008; Wojtasz et al. 2009; Roig et al. 2010; Vader et al. 2011; Miao et al. 2013; Chen et al. 2014; Lo et al. др. 2014). Мутанты, лишенные TRIP13 Pch3 , имеют ряд общих фенотипических признаков с мутантами, лишенными ATM или ATR, что согласуется с моделью, согласно которой TRIP13 Pch3 необходим для полной активации MCN (San-Segundo and Roeder 1999; Borner et al.2008 г.; Джоши и др. 2009 г.; Джойс и МакКим 2009, 2010; Войташ и др. 2009 г.; Зандерс и Алани, 2009 г.; Роиг и др. 2010 г.; Зандерс и др. 2011 г.; Фармер и др. 2012). Эти эффекты, вероятно, в значительной степени являются вторичным последствием нарушения функции HORMAD, хотя у S. cerevisiae TRIP13 Pch3 также напрямую модулирует ATM Tel1 , взаимодействуя с комплексом MRN Xrs2 (Ho and Burgess 2011). .

Генерация сигналов

Хромосомная архитектура может также лежать в основе одного из наиболее сложных аспектов регуляции мейотических контрольных точек, способность MCN реагировать на дефекты синапсов независимо от SPO11-индуцированных DSB (Barchi et al.2005 г.; Беллани и др. 2005 г.; Бхалла и Дернбург, 2005 г.; Барбоза и др. 2007 г.; Джойс и МакКим, 2009 г.; Лу и др. 2010). Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что особенности структуры хромосом, специфичной для мейоза, сами по себе могут активировать МКС. В большинстве случаев активность контрольной точки в ответ на асинапсис требует активности TRIP13 Pch3 на белках HORMAD (Bhalla and Dernburg 2005; Joyce and McKim 2009, 2010; Kogo et al. 2012a; Wojtasz et al. 2012), а в некоторых В некоторых случаях также требуется активность гистондеацетилазы Sir2 (San-Segundo and Roeder 1999; Joyce and McKim 2010; Pek et al.2012).

Какая независимая от DSB особенность структуры хромосом в конечном итоге инициирует сигнал MCN, остается неясным. Мелкий убиквитин-подобный белковый модификатор SUMO может участвовать в формировании сигнала, так как это одна из самых ранних меток, отличающих несинапсированные половых хромосом для MSCI (Vigodner 2009) и участвует в активации MCN у S. cerevisiae (Eichinger and Jentsch 2010).Однако накопление SUMO на половых хромосомах зависит от ATR (Royo et al. 2013), что указывает на то, что сигналом в данном случае служит другой аспект асинапса. Возможно, наличие HORMAD на несинапсированных хромосомах сам является сигналом, активирующим MCN. У мышей HORMAD1 играет несколько ролей в профазе мейоза. (Shin et al. 2010, 2013; Daniel et al. 2011), тогда как HORMAD2 избирательно необходим для SPO11-независимого распространения γ-h3AFX и MSUC/MSCI (Wojtasz et al.2012). Поскольку HORMAD2 напрямую связывается с HORMAD1 (Wojtasz et al. 2012), интригующая возможность заключается в том, что колокализация HORMAD1/2 создает независимый от SPO11 сигнал для активации MCN. Прямой Функция HORMAD, активирующая контрольную точку, также подтверждается наблюдением, что мутантов C. elegans преждевременно экспрессирующих белок HORMAD HTP-3 останавливают при входе в мейоз ATM ATL-1 -зависимым образом без явного повреждения ДНК (Burger et al. . 2013).В качестве альтернативы, может существовать независимый от SPO11 источник образования DSB и активации MCN, на что указывают недавние исследования. наблюдение SPO11-независимых очагов репарации ДНК на несинапсированных участках хромосом мейоцитов мыши, а также SPO11-независимых кроссоверы у Coprinus cinereus (Carofiglio et al. 2013; Crown et al. 2013).

Модуляция отклика

Еще одной интересной особенностью МКН является относительная нечувствительность к повреждениям, наблюдаемая в нескольких ветвях этого сеть.Напр., в то время как митотические клетки S. cerevisiae останавливаются в ответ на одиночный индуцированный DSB (Lee et al. 2000), то же самое поражение не вызывает сопоставимого ответа в мейотической профазе (Malkova et al. 1996). Подобная нечувствительность к повреждению также наблюдается в ооцитах мышей (Marangos and Carroll 2012). Интересно, что каноническая киназа контрольной точки S. cerevisiae CHK2 Rad53 , которая запускает реакцию остановки в митотических клетках, не имеет доступа к мейотическим хромосомам. в большинстве случаев (Cartagena-Lirola et al. 2008) и поддерживается в неактивном состоянии протеинфосфатазой 4 (Falk et al. 2010). В самом деле, избыточная экспрессия киназы CHK2 Rad53 задерживает прогрессию мейоза (Usui and Kanehara 2013). И наоборот, также существуют эффекты титрования, при которых слишком много аберрантных структур ухудшают нормальную реакцию контрольной точки. В частности, ответ MSUC у мышей нарушается при наличии слишком большого количества несинапсированных хромосом (Mahadevaiah et al. 2008; Kouznetsova et al.2009). Это может указывать на ограничение сигнализации для ответа MSUC, а также может обеспечивать защиту от инициирования MSUC в ранние стадии мейотической профазы, когда большинство хромосом не синапсированы.

Интеграция и разделение сигналов

Сложность сети мейотических контрольных точек ставит вопрос о том, как сигналы интегрируются или разделяются. Банкомат и АТР достичь интеграции сигнала, просто фосфорилируя многие из одних и тех же сайтов-мишеней. Таким образом, наличие тупых ДНК заканчивается и ssDNA может как вызывать задержку мейотической прогрессии (Hochwagen and Amon 2006; Wu and Burgess 2006), так и обе киназы могут стимулировать резекцию ДНК и регулировать выбор партнера для репарации (Cartagena-Lirola et al. 2006; Carballo et al. 2008).

В других случаях, вероятно, необходимо избегать перекрестных помех между сигналами.Например, ATR Mec1 по-разному регулирует образование DSB в ответ на остановку репликации во время премейотической S-фазы по сравнению с лептонемой. когда началось формирование DSB (Argunhan et al. 2013; Blitzblau and Hochwagen 2013; Carballo et al. 2013; Cheng et al. 2013; Gray et al. 2013). Точно так же осевые белки (например, HORMAD1) собираются на хромосомах одновременно с репликацией ДНК, но становятся только ATR. субстраты на формирование DSB (Carballo et al.2008 г.; Войташ и др. 2009 г.; Блицблау и др. 2012 г.; Ченг и др. 2013). Одним из способов достижения разделения сигналов является использование альтернативных сигнальных комплексов, таких как использование разных киназ CHK2. (Blitzblau and Hochwagen 2013), или различные сигнальные платформы, как недавно было предложено для альтернативных комплексов 9-1-1, активных во время мышей. профаза мейоза (Lyndaker et al., 2013a,b; Васильева и др., 2013). Решение о том, какой сигнальный комплекс будет в конечном итоге активирован, вероятно, зависит от определенного спектра MCN. взаимодействия, которые возможны в ответвлениях репликации, DSB или несинапсированных регионах, и поэтому снова будут сильно зависеть от контекста. зависимый.

Наконец, в настоящее время имеются существенные доказательства того, что сигнальная среда MCN эволюционирует в течение профазы мейоза. У S. cerevisiae и мыши существуют явные различия во времени появления и исчезновения специфических событий фосфорилирования, опосредованных MCN. (Барчи и др., 2005; Беллани и др., 2005; Фукуда и др., 2012; Ченг и др., 2013). Особый интерес здесь представляет вступление в пахинему, связанное с очевидным переключением сигнальных и свойства отклика MCN.Например, фосфорилированные формы HORMADs и CHK2 Mek1 специфически исчезают при пахинеме (Cartagena-Lirola et al. 2008; Fukuda et al. 2012; Cheng et al. 2013). У C. elegans экзогенные DSB могут запускать ядерную реорганизацию и стойкое фосфорилирование SUN-1 при лептонеме/зигонеме, но не при pachynema (Woglar and Jantsch, 2013). Более того, выбор пути репарации экзогенных DSB также меняется на более поздних стадиях профазы мейоза (Rosu et al.2011 г.; Либуда и др. 2013). Временная эволюция активности MCN может в некоторых случаях быть результатом стадийно-специфической активации фосфатаз, удаляющих Сигналы, зависящие от MCN (Bailis et al. 2000; Hochwagen and Amon 2006; Falk et al. 2010; Cheng et al. 2013). Кроме того, в пространственно структурированных гонадах многоклеточных животных также возможна временная дифференциация ответа контрольной точки. передаваться внешними сигналами. Например, у гермафродитов C. elegans апоптоз, индуцированный контрольной точкой, ограничивается передачей сигналов Ras/MAP киназы к поздней пахинеме, возможно, чтобы избежать неадекватная индукция гибели клеток на более ранних стадиях, когда преобладают SPO11-индуцированные DSB (Rutkowski et al.2011). Таким образом, MCN объединяет как пространственную, так и временную информацию, чтобы создать высококонтекстно-зависимый координационный центр. для пошагового прохождения мейотической профазы.

ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ

Наше понимание многоканальной сети за последние несколько лет значительно улучшилось, хотя с новыми идеями, новыми возникли экспериментальные задачи. Все более очевидная взаимосвязанность MCN означает, что сигнальные выходы следует понимать как суммирование сигнальных ветвей, которые модулируют и дают обратную связь друг другу. Рассечение этой сети потребуются более точно регулируемые генетические инструменты, новые подходы к моделированию, а также лучшее описание мейотических структура хромосом. Обнадеживает тот факт, что скорость обнаружения прямых мишеней MCN во множестве организмов растет. наряду с первыми приложениями анализа на системном уровне, изучение MCN явно достигло нового этапа, и всестороннее понимание многоканальной сети становится доступным.В конечном счете, конечно, главная цель этого исследования состоит в том, чтобы использовать новые знания о MCN для лучшего понимания наследования и фертильности хромосом человека. Поскольку MCN модулирует время и активность мейотических процессов, частичные мутации с потерей функции компонентов MCN, как ожидается, будут иметь большое влияние на качество гамет. Растущее изобилие полных геномных данных пациентов сулит большие надежды в этом отношении.В в ближайшие годы, основанные на исследованиях, проведенных на модельных организмах, мы ожидаем, что эти данные обеспечат важное понимание в высокой частоте самопроизвольных абортов и хромосомных врожденных дефектов у людей.

БЛАГОДАРНОСТИ

Эта работа поддерживается Национальным институтом здравоохранения Грант GM088248 для А.Х.

Сноски

  • Редакторы: Стивен Ковальчиковски, Нил Хантер и Вольф-Дитрих Хейер

  • Дополнительные перспективы рекомбинации ДНК доступны на сайте www. cshperspectives.org

  • Copyright © 2014 Cold Spring Harbour Laboratory Press; все права защищены

Контрольная точка пре-В-клеточного рецептора при остром лимфобластном лейкозе

  • Мурман А.В.Клиническая значимость хромосомных и геномных аномалий при остром лимфобластном лейкозе предшественников В-клеток. Blood Rev 2012; 26 : 123–135.

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Pui CH, Mullighan CG, Evans WE, Relling MV . Детский острый лимфобластный лейкоз: куда мы идем и как мы туда доберемся? Кровь 2012; 120 : 1165–1174.

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Робертс К.Г., Маллиган К.Г. Как новые достижения в генетическом анализе влияют на понимание и лечение острого лейкоза у детей. Curr Opin Pediatr 2011; 23 : 34–40.

    КАС пабмед Google ученый

  • Харрисон С.Дж., Хаас О., Харботт Дж., Бионди А., Станулла М., Трка Дж. и др. .Выявление прогностически значимых генетических аномалий при остром лимфобластном лейкозе у детей из предшественников В-клеток: рекомендации Комитета по биологии и диагностике Международной исследовательской группы Берлин-Франкфурт-Мюнстер. Бр Дж Гематол 2010; 151 : 132–142.

    КАС пабмед Google ученый

  • Zhang J, Mullighan CG, Harvey RC, Wu G, Chen X, Edmonson M et al . Ключевые пути часто мутируют при остром лимфобластном лейкозе у детей с высоким риском: отчет детской онкологической группы. Кровь 2011; 118 : 3080–3087.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Маллиган К. Г., Гурха С., Радтке И., Миллер С.Б., Кустан-Смит Э., Далтон Д.Д. и др. . Полногеномный анализ генетических изменений при остром лимфобластном лейкозе. Природа 2007; 446 : 758–764.

    КАС Google ученый

  • Мурман А.В., Эншай А., Шваб С., Уэйд Р., Чилтон Л., Эллиотт А. и др. .Новая интегрированная цитогенетическая и геномная классификация уточняет стратификацию риска острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) у детей. Кровь 2014; 124 : 1434–1444.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Ле Визёр К., Хотфилдер М., Бомкен С., Уилсон К., Роттгерс С., Шраудер А. и др. . При остром лимфобластном лейкозе у детей бласты на разных стадиях иммунофенотипического созревания обладают свойствами стволовых клеток. Раковая ячейка 2008 г.; 14 : 47–58.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Рехе К. , Уилсон К., Бомкен С., Уильямсон Д., Ирвинг Дж., Ден Бур М.Л. и др. . Клетки, размножающиеся при остром В-лимфобластном лейкозе, с высокой частотой присутствуют в различных популяциях лимфобластов. EMBO Мол Мед 2013; 5 : 38–51.

    КАС пабмед Google ученый

  • Дик Дж. Э. .Концепция стволовых клеток обновляет исследования рака. Кровь 2008; 112 : 4793–4807.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Херцог С., Рет М., Джумаа Х. Регуляция пролиферации и дифференцировки В-клеток с помощью передачи сигналов пре-В-клеточного рецептора. Nat Rev Immunol 2009; 9 : 195–205.

    КАС Google ученый

  • Матиас П., Rolink AG .Транскрипционные сети в развивающихся и зрелых В-клетках. Nat Rev Immunol 2005; 5 : 497–508.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Риккерт RC . Новое понимание сигналов pre-BCR и BCR, имеющих отношение к злокачественным новообразованиям B-клеток. Nat Rev Immunol 2013; 13 : 578–591.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Мелхерс Ф .Рецептор пре-В-клеток: селектор подходящих тяжелых цепей иммуноглобулина для репертуара В-клеток. Nat Rev Immunol 2005; 5 : 578–584.

    КАС пабмед Google ученый

  • Китамура Д., Роуз Дж., Кун Р., Раевски К. . Мышь с дефицитом В-клеток путем целенаправленного разрушения экзона мембраны гена мю-цепи иммуноглобулина. Природа 1991; 350 : 423–426.

    КАС пабмед Google ученый

  • Хендрикс Р. В., Миддендорп С .Контрольная точка перед BCR как переключатель клеточно-автономной пролиферации. Трендс Иммунол 2004; 25 : 249–256.

    КАС пабмед Google ученый

  • Кларк М.Р., Мандал М., Очиаи К., Сингх Х. Управление лимфопоэзом В-клеток посредством взаимодействия рецептора IL-7 и передачи сигналов пре-В-клеточного рецептора. Nat Rev Immunol 2014; 14 : 69–80.

    КАС пабмед Google ученый

  • Купперс Р .Механизмы патогенеза В-клеточной лимфомы. Nat Rev Рак 2005; 5 : 251–262.

    ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

  • Янг Р.М., Штаудт Л.М. Ориентация на патологическую передачу сигналов рецептора В-клеток при лимфоидных злокачественных новообразованиях. Nat Rev Drug Discov 2013; 12 : 229–243.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Гэн Х., Хурц С., Ленц К.Б., Чен З., Баумйохан Д., Томпсон С. и др. .Самоусиливающаяся активация обратной связи между сигналами BCL6 и рецептора пре-В-клеток определяет отдельный подтип острого лимфобластного лейкоза. Раковая клетка 2015; 27 : 409–425.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Шмитц Р., Янг Р.М., Церибелли М., Джавар С., Сяо В., Чжан М. и др. . Патогенез лимфомы Беркитта и терапевтические мишени из структурной и функциональной геномики. Природа 2012; 490 : 116–120.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Burger JA, Okkenhaug K . Гематологический рак: иделалисиб, нацеленный на PI3Kdelta, у пациентов с В-клеточными злокачественными новообразованиями. Nat Rev Clin Oncol 2014; 11 : 184–186.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Дэвис Р.Э., Нго В.Н., Ленц Г., Толар П., Янг Р.М., Ромессер П.Б. и др. .Хроническая активная передача сигналов В-клеточного рецептора при диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфоме. Природа 2010; 463 : 88–92.

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Byrd JC, Furman RR, Coutre SE, Flinn IW, Burger JA, Blum KA и др. . Нацеливание на БТК с помощью ибрутиниба при рецидивирующем хроническом лимфоцитарном лейкозе. N Engl J Med 2013; 369 : 32–42.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Канцлер Х., Купперс Р., Хансманн М.Л., Раевски К. .Клетки Ходжкина и Рида-Штернберга при болезни Ходжкина представляют собой результат доминантного опухолевого клона, полученного из (поврежденных) В-клеток зародышевого центра. J Exp Med 1996; 184 : 1495–1505.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Лейтхаузер Ф., Бауэрле М., Хьюн М.К., Моллер П. . Гены иммуноглобулина с переключением изотипа с высокой нагрузкой соматической гипермутацией и отсутствием продолжающейся мутационной активности преобладают при медиастинальной В-клеточной лимфоме. Кровь 2001; 98 : 2762–2770.

    КАС пабмед Google ученый

  • Хобейка Э., Нильсен П.Дж., Медьеси Д. Сигнальные механизмы, регулирующие активацию и толерантность В-лимфоцитов. J Mol Med 2015; 93 : 143–158.

    КАС пабмед Google ученый

  • Кляйн Ф. , Фельдхан Н., Мушен М. . Интерференция активности киназы BCR-ABL1 с передачей сигналов антигенного рецептора в клетках-предшественниках В-клеток лейкемии. Клеточный цикл 2004; 3 : 858–860.

    КАС пабмед Google ученый

  • Кляйн Ф., Фельдхан Н., Хардер Л., Ван Х., Вартенберг М., Хофманн В.К. и др. . Киназа BCR-ABL1 обходит отбор на экспрессию пре-В-клеточного рецептора в пре-В-клеточных клетках острого лимфобластного лейкоза. J Exp Med 2004; 199 : 673–685.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Трагезер Д., Якобуччи И., Нахар Р., Дуй С., фон Леветцов Г., Клемм Л. и др. .Опосредованная пре-В-клеточными рецепторами остановка клеточного цикла при остром лимфобластном лейкозе с филадельфийской хромосомой требует функции IKAROS. J Exp Med 2009; 206 : 1739–1753.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Мангум Д.С., Дауни Дж., Мейсон К.С., Джахроми М.С., Джоши Д., Родик В. и др. . Делеции VPREB1 возникают независимо от перестройки легкой цепи лямбда при остром лимфобластном лейкозе у детей. Лейкемия 2014; 28 : 216–220.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Сваминатан С., Хуанг С., Генг Х., Чен З., Харви Р., Канг Х. и др. . BACh3 опосредует негативный отбор и р53-зависимую супрессию опухоли в контрольной точке пре-В-клеточного рецептора. Nat Med 2013; 19 : 1014–1022.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Ояке Т., Ито К., Мотохаши Х., Хаяси Н., Хосино Х., Нисидзава М. и др. .Белки Bach принадлежат к новому семейству факторов транскрипции BTB-basic leucine zipper, которые взаимодействуют с MafK и регулируют транскрипцию через сайт NF-E2. Mol Cell Biol 1996; 16 : 6083–6095.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Кавамата Н., Пеннелла М.А., Ву Дж.Л., Берк А.Дж., Коффлер Х.П. Доминантно-негативный механизм лейкемогенных слияний PAX5. Онкоген 2012; 31 : 966–977.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Ан К., Райт С.Л., Конн З.Дж., Мэтисон Э., Минто Л., Мурман А.В. и др. . Вариабельные точки разрыва нацелены на PAX5 у пациентов с дицентрическими хромосомами: модель основы несбалансированных транслокаций при раке. Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105 : 17050–17054.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Фацио Г., Каззанига В., Пальми К., Гальбиати М., Джордан М., Кронни Г. и др. .PAX5/ETV6 изменяет профиль экспрессии генов В-клеток-предшественников с противоположным доминантным эффектом на эндогенный PAX5. Лейкемия 2013; 27 : 992–995.

    КАС пабмед Google ученый

  • Та В.Б., де Брюйн М.Дж., тер Брюгге П.Дж., ван Гамбург Дж.П., Дипстратен Х.Дж., ван Лоо П.Ф. и др. . Злокачественная трансформация пре-В-клеток с дефицитом Slp65 включает нарушение пути супрессора опухоли Arf-Mdm2-p53. Кровь 2010; 115 : 1385–1393.

    КАС пабмед Google ученый

  • Jumaa H, Bossaller L, Portugal K, Storch B, Lotz M, Flemming A и др. . Дефицит адаптера SLP-65 при пре-В-клеточном остром лимфобластном лейкозе. Природа 2003; 423 : 452–456.

    КАС пабмед Google ученый

  • Флемминг А. , Браммер Т., Рет М., Джумаа Х.Адаптерный белок SLP-65 действует как супрессор опухоли, который ограничивает размножение пре-В-клеток. Нат Иммунол 2003; 4 : 38–43.

    КАС пабмед Google ученый

  • Мейксльпергер С., Колер Ф., Восснинг Т., Реппель М., Мушен М., Джумаа Х. Обычные легкие цепи ингибируют автономную сигнальную способность В-клеточного рецептора. Иммунитет 2007; 26 : 323–333.

    КАС пабмед Google ученый

  • Керсебум Р., Миддендорп С., Дингжан Г.М., Даленборг К., Рет М., Джумаа Х. и др. .Тирозинкиназа Брутона взаимодействует с линкерным белком В-клеток SLP-65 в качестве супрессора опухоли в пре-В-клетках. J Exp Med 2003; 198 : 91–98.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Денглер Х. С., Барачо Г.В., Омори С.А., Брукнер С., Арден К.С., Castrillon DH и др. . Различные функции фактора транскрипции Foxo1 на разных стадиях дифференцировки В-клеток. Нат Иммунол 2008; 9 : 1388–1398.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Накаяма Дж., Ямамото М., Хаяси К., Сатох Х., Бундо К., Кубо М. и др. . BLNK подавляет пре-В-клеточный лейкоз за счет ингибирования JAK3. Кровь 2009; 113 : 1483–1492.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Нахар Р., Рамезани-Рад П., Мосснер М., Дуй С., Черкьетти Л., Генг Х. и др. .Активация BCL6, опосредованная рецептором пре-В-клеток, вызывает покой пре-В-клеток за счет репрессии транскрипции MYC. Кровь 2011; 118 : 4174–4178.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Маллиган К. Г., Миллер С.Б., Радтке И., Филлипс Л.А., Далтон Дж., Ма Дж. и др. . Лимфобластный лейкоз BCR-ABL1 характеризуется делецией Ikaros. Природа 2008; 453 : 110–114.

    КАС Google ученый

  • Imai C, Ross ME, Reid G, Coustan-Smith E, Schultz KR, Pui CH и др. . Экспрессия адапторного белка BLNK/SLP-65 при остром лимфобластном лейкозе у детей. Лейкемия 2004; 18 : 922–925.

    КАС пабмед Google ученый

  • Гудман П.А., Вуд К.М., Василев А.О., Мао К., Укун Ф.М. Дефектная экспрессия тирозинкиназы Брутона при остром лимфобластном лейкозе. Лейк-лимфома 2003; 44 : 1011–1018.

    КАС пабмед Google ученый

  • Хосино А., Окуно Ю., Мигита М., Бан Х., Ян Х., Киёкава Н. и др. . Х-сцепленная агаммаглобулинемия, связанная с В-предшественником острого лимфобластного лейкоза. J Clin Immunol 2015; 35 : 108–111.

    КАС пабмед Google ученый

  • Конли, штат Мэн.Имеют ли пациенты с Х-сцепленной агаммаглобулинемией повышенный риск развития острого лимфобластного лейкоза? J Clin Immunol 2015; 35 : 98–99.

    ПабМед Google ученый

  • Сулонг С., Мурман А.В., Ирвинг Дж.А., Стреффорд Дж.С., Конн З.Дж., Кейс М.К. и др. . Всесторонний анализ гена CDKN2A при остром лимфобластном лейкозе у детей выявляет геномную делецию, потерю гетерозиготности с нейтральным числом копий и ассоциацию со специфическими цитогенетическими подгруппами. Кровь 2009; 113 : 100–107.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Захариадис В., Шуманс Дж., Барбани Г., Хейман М., Форестье Э. , Йоханссон Б. и др. . Гомозиготные делеции CDKN2A присутствуют во всех dic(9;20)(p13.2;q11.2)-положительных предшественниках B-клеток остром лимфобластном лейкозе и могут быть важны для лейкемической трансформации. Бр Дж Гематол 2012; 159 : 488–491.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Китамура Д., Кудо А., Шаал С., Мюллер В., Мелчерс Ф., Раевски К. . Критическая роль белка лямбда 5 в развитии В-клеток. Сотовый 1992; 69 : 823–831.

    КАС пабмед Google ученый

  • Брэдл Х., Джек Х.М. Опосредованное суррогатной легкой цепью взаимодействие растворимого рецептора пре-В-клеток с прикрепленными клеточными линиями. J Иммунол 2001; 167 : 6403–6411.

    КАС пабмед Google ученый

  • Gauthier L, Rossi B, Roux F, Termine E, Schiff C . Галектин-1 представляет собой стромальный клеточный лиганд рецептора пре-В-клеток (BCR), участвующего в формировании синапсов между пре-В- и стромальными клетками и в запуске пре-ВКР. Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99 : 13014–13019.

    КАС пабмед Google ученый

  • Монро Дж.Г.ITAM-опосредованная тоническая передача сигналов через комплексы pre-BCR и BCR. Nat Rev Immunol 2006; 6 : 283–294.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Колер Ф., Хуг Э., Эшбах С., Мейксльпергер С., Хобейка Э., Кофер Дж. и др. . Рецепторы аутореактивных В-клеток имитируют автономную передачу сигналов рецепторов пре-В-клеток и индуцируют пролиферацию ранних В-клеток. Иммунитет 2008; 29 : 912–921.

    ПабМед Google ученый

  • Убельхарт Р. , Бах М.П., ​​Эшбах С., Восснинг Т., Рет М., Джумаа Х. N-связанное гликозилирование избирательно регулирует функцию автономных предшественников BCR. Нат Иммунол 2010; 11 : 759–765.

    ПабМед Google ученый

  • Су Ю.В., Джумаа Х . LAT связывает пре-BCR с передачей сигналов кальция. Иммунитет 2003; 19 : 295–305.

    КАС пабмед Google ученый

  • Ясуда Т., Санджо Х., Пейдж Г., Кавано Ю., Карасуяма Х., Пуйссегур Дж. и др. . Киназы Erk связывают передачу сигналов рецептора пре-В-клеток с транскрипционными событиями, необходимыми для ранней экспансии В-клеток. Иммунитет 2008; 28 : 499–508.

    КАС пабмед Google ученый

  • Иритани Б.М., Форбуш К.А., Фаррар М.А., Перлмуттер Р.М.Контроль развития В-клеток с помощью Ras-опосредованной активации Raf. EMBO J 1997; 16 : 7019–7031.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Восснинг Т., Херцог С., Колер Ф., Мейксльпергер С., Кулату Ю., Миттлер Г. и др. . Дерегулируемый Syk ингибирует дифференцировку и индуцирует независимую от фактора роста пролиферацию пре-В-клеток. J Exp Med 2006; 203 : 2829–2840.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Укун Ф.М., Кази С. SYK как новая терапевтическая мишень при остром лимфобластном лейкозе с предшественниками В-клеток. J Рак Ther 2014; 5 : 124–131.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Grawunder U, Leu TM, Schatz DG, Werner A, Rolink AG, Melchers F и др. .Снижение экспрессии генов RAG1 и RAG2 в preB-клетках после функциональной перестройки тяжелой цепи иммуноглобулина. Иммунитет 1995; 3 : 601–608.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Очиаи К., Майеншайн-Клайн М., Мандал М., Триггс Дж. Р., Бертолино Э., Шиаммас Р. и др. . Самоусиливающаяся регуляторная сеть, запускаемая ограничением IL-7, активирует передачу сигналов и дифференцировку pre-BCR. Нат Иммунол 2012; 13 : 300–307.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Амин Р.Х., Шлиссель М.С. Foxo1 напрямую регулирует транскрипцию генов, активирующих рекомбинацию, во время развития В-клеток. Нат Иммунол 2008; 9 : 613–622.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Фельдхан Н., Кляйн Ф., Мустер Дж.Л., Хадвех П., Спрангерс М., Вартенберг М. и др. .Мимикрия конститутивно активного пре-В-клеточного рецептора в клетках острого лимфобластного лейкоза. J Exp Med 2005; 201 : 1837–1852.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Duy C, Yu JJ, Nahar R, Swaminathan S, Kweon SM, Polo JM и др. . BCL6 имеет решающее значение для развития разнообразного репертуара первичных В-клеток. J Exp Med 2010; 207 : 1209–1221.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Duy C, Hurtz C, Shojaee S, Cerchietti L, Geng H, Swaminathan S и др. . BCL6 позволяет Ph+ клеткам острого лимфобластного лейкоза пережить ингибирование киназы BCR-ABL1. Природа 2011; 473 : 384–388.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Гэн Х. , Бреннан С., Милн Т.А., Чен В.Ю., Ли И., Хурц С. и др. .Интегративный эпигеномный анализ определяет биомаркеры и терапевтические мишени при остром В-лимфобластном лейкозе у взрослых. Рак Дисков 2012; 2 : 1004–1023.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Бикокка В.Т., Чанг Б.Х., Масуле Б.К., Мушен М., Лорио М.М., Друкер Б.Дж. и др. . Взаимодействие между ROR1 и рецептором Pre-B клеток способствует выживанию при остром лимфобластном лейкозе t(1;19). Раковая клетка 2012; 22 : 656–667.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • ван дер Вир А., ван дер Велден В.Х., Виллемс М.Е., Хогевен П.Г., Петрикоин Э.Ф., Беверлоо Х.Б. и др. . Вмешательство в передачу сигналов пре-В-клеточных рецепторов предлагает терапевтический вариант для лечения острого лимфобластного лейкоза у детей с реаранжировкой TCF3. Рак крови J 2014; 4 : e181.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Брум Х.Е., Рассенти Л.З., Ван Х.И., Мейер Л.М., Киппс Т.Дж.ROR1 экспрессируется на гематогонах (неопухолевых предшественниках В-лимфоцитов человека) и в меньшинстве предшественников-В острого лимфобластного лейкоза. Лейк Рез 2011; 35 : 1390–1394.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Fine BM, Stanulla M, Schrappe M, Ho M, Viehmann S, Harbott J и др. . Паттерны экспрессии генов, связанные с повторяющимися хромосомными транслокациями при остром лимфобластном лейкозе. Кровь 2004; 103 : 1043–1049.

    КАС Google ученый

  • Интал А., Крапф Г., Бек Д., Джоас Р., Кауэр М.О., Орел Л. и др. . Роль рецептора эритропоэтина в ETV6/RUNX1-положительном остром лимфобластном лейкозе. Clin Cancer Res 2008; 14 : 7196–7204.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • ван Делфт Ф.В., Беллотти Т., Луо З., Джонс Л.К., Патель Н., Янникурис О. и др. .Проспективный анализ экспрессии генов точно подтипирует острый лейкоз у детей и устанавливает общность между гипердиплоидией и t(12;21) при остром лимфобластном лейкозе. BrJ Haematol 2005; 130 : 26–35.

    КАС пабмед Google ученый

  • Торрано В., Проктер Дж., Кардус П., Гривз М., Форд А.М. ETV6-RUNX1 способствует выживанию клеток-предшественников ранней линии В через нарушение регуляции рецептора эритропоэтина. Кровь 2011; 118 : 4910–4918.

    КАС пабмед Google ученый

  • Рассел Л. Дж., Акасака Т., Маджид А., Сугимото К.Дж., Лорейн Карран Э., Нагель I и др. . t(6;14)(p22;q32): новая рецидивирующая транслокация [email protected] с участием ID4 при остром лимфобластном лейкозе предшественников B-клеток (BCP-ALL). Кровь 2008; 111 : 387–391.

    КАС Google ученый

  • Робертс К.Г., Морин Р.Д., Чжан Дж., Херст М., Чжао Ю., Су Х и др. .Генетические изменения, активирующие передачу сигналов рецептора киназы и цитокина при остром лимфобластном лейкозе высокого риска. Раковая клетка 2012; 22 : 153–166.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Рассел Л.Дж., Де Кастро Д.Г., Гриффитс М., Телфорд Н., Бернард О., Панцер-Грумайер Р. и др. . Новая транслокация t(14;19)(q32;p13) с участием [email protected] и цитокинового рецептора эритропоэтина. Лейкемия 2009; 23 : 614–617.

    КАС пабмед Google ученый

  • Рассел Л.Дж., Капассо М., Фатер И., Акасака Т., Бернард О.А., Каласанц М.Дж. и др. . Нарушенная экспрессия гена рецептора цитокинов, CRLF2, вовлечена в лимфоидную трансформацию при остром лимфобластном лейкозе, являющемся предшественником В-клеток. Кровь 2009; 114 : 2688–2698.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Рассел Л.Дж., Эншай А., Джонс Л., Эрхорн А., Масик Д., Бентли Х и др. .Транслокации [email protected] распространены у подростков и молодых людей с острым лимфобластным лейкозом и связаны с неблагоприятным исходом. J Clin Oncol 2014; 32 : 1453–1462.

    ПабМед Google ученый

  • Мурман А.В., Шваб С., Энсор Х.М., Рассел Л.Дж., Моррисон Х., Джонс Л. и др. . Транслокации [email protected], дерегуляция CRLF2 и микроделеции у подростков и взрослых с острым лимфобластным лейкозом. J Clin Oncol 2012; 30 : 3100–3108.

    ПабМед Google ученый

  • Шочат С., Таль Н., Бандапалли О.Р., Пальми С., Ганмор И., Кронни Г. и др. . Мутации с усилением функции в рецепторе интерлейкина-7-альфа (IL7R) при остром лимфобластном лейкозе у детей. J Exp Med 2011; 208 : 901–908.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Tasian SK, Doral MY, Borowitz MJ, Wood BL, Chen IM, Harvey RC и др. .Аберрантная передача сигналов пути STAT5 и PI3K/mTOR возникает при остром лимфобластном лейкозе человека с реаранжированным CRLF2 B-предшественником. Кровь 2012; 120 : 833–842.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Den Boer ML, van Slegtenhorst M, De Menezes RX, Cheok MH, Buijs-Gladdines JG, Peters ST и др. . Подтип детского острого лимфобластного лейкоза с плохим исходом лечения: полногеномное классификационное исследование. Ланцет Онкол 2009; 10 : 125–134.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Mullighan CG, Su X, Zhang J, Radtke I, Phillips LA, Miller CB и др. . Делеция IKZF1 и прогноз при остром лимфобластном лейкозе. N Engl J Med 2009; 360 : 470–480.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Робертс К.Г., Ли И., Пейн-Тернер Д., Харви Р.К., Ян Ю.Л., Пей Д. и др. .Целенаправленные поражения, активирующие киназу, при Ph-подобном остром лимфобластном лейкозе. N Engl J Med 2014; 371 : 1005–1015.

    ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

  • Лох М. Л., Чжан Дж., Харви Р.К., Робертс К., Пейн-Тернер Д., Канг Х. и др. . Секвенирование тирозинового кинома при остром лимфобластном лейкозе у детей: отчет Детской онкологической группы TARGET Project. Кровь 2013; 121 : 485–488.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Тримарчи Т., Айфантис И. . Pre-BCR спешит на помощь: терапевтическое воздействие на pre-B-клеточный ALL. Раковая клетка 2015; 27 : 321–323.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Вейланд Дж., Старейшина А., Форстер В., Хайденрайх О., Кошмидер С., Формур Дж. CD19: многофункциональная иммунологическая молекула-мишень и ее значение для острого лимфобластного лейкоза Blineage. Детский рак крови 2015.

  • Гэн Х, Чен З, Парк Э, Клемм Л, Бейли К.С., Мушен М. . Ifitm3 (CD225) опосредует CD19-зависимое выживание и пролиферацию во время нормального развития В-клеток и при Ph+ ALL. Кровь J 2013; том. 122 : 2505–2505.

    Google ученый

  • Хобейка Э., Левит-Зердун Э., Анастасопулу В., Полмейер Р., Альтмайер С., Альсадек А. и др. . CD19 и BAFF-R могут способствовать выживанию В-клеток в отсутствие Syk. Embo J 2015; 34 : 925–939.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Кенигсбергер С., Кифер Ф. Непонятная функция Syk в гомеостазе B-клеток. EMBO J 2015; 34 : 838–840.

    ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

  • Штакельберг Авеню . Исследование фазы 1/2 блинатумомаба у педиатрических пациентов с рецидивирующим/рефрактерным острым лимфобластным лейкозом из предшественников В-клеток. Кровь 2013; 122 : 70.

    Google ученый

  • Шлегель П., Ланг П., Цугмайер Г., Эбингер М., Крайенберг Х., Витте К.Е. и др. . Рецидивирующий/рефрактерный острый лимфобластный лейкоз у детей после трансплантации демонстрирует длительную ремиссию при терапии биспецифическим антителом, связывающим Т-клетки, блинатумомабом. Гематологический 2014; 99 : 1212–1219.

    ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

  • Хёльцер Д .Новые методы лечения острого лимфобластного лейкоза на основе антител. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2011; 2011 : 243–249.

    ПабМед Google ученый

  • Фридберг Дж.В., Шарман Дж., Суитенхэм Дж., Джонстон П.Б., Восе Дж.М., Лакас А. и др. . Ингибирование Syk динатрием фостаматинибом имеет значительную клиническую активность при неходжкинской лимфоме и хроническом лимфоцитарном лейкозе. Кровь 2010; 115 : 2578–2585.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Чен Л., Монти С., Ющински П., Дейли Дж., Чен В., Витциг Т.Е. и др. . SYK-зависимая передача сигналов тонического В-клеточного рецептора является рациональной целью лечения диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы. Кровь 2008; 111 : 2230–2237.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Hoellenriegel J, Coffey GP, Sinha U, Pandey A, Sivina M, Ferrajoli A et al .Селективные новые ингибиторы тирозинкиназы селезенки (Syk) подавляют активацию и миграцию В-клеток хронического лимфоцитарного лейкоза. Лейкемия 2012; 26 : 1576–1583.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Chen Z, Shojaee S, Buchner M, Geng H, Lee JW, Klemm L и др. . Сигнальные пороги и отрицательный отбор В-клеток при остром лимфобластном лейкозе. Природа 2015; 521 : 357–361.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Бургер Дж.А., Багги Дж.Дж. Ингибитор тирозинкиназы Брутона ибрутиниб (PCI-32765). Лейк-лимфома 2013; 54 : 2385–2391.

    КАС Google ученый

  • Хендрикс РВ . Открытие лекарства: новый ингибитор Btk обнадеживает. Nat Chem Biol 2011; 7 : 4–5.

    КАС пабмед Google ученый

  • Фруман Д.А., Роммель К.Ингибиторы PI3Kdelta при раке: обоснование и случайность сливаются в клинике. Рак Дисков 2011; 1 : 562–572.

    КАС пабмед Google ученый

  • Wiemels JL, Zhang Y, Chang J, Zheng S, Metayer C, Zhang L и др. . Мутация RAS связана с гипердиплоидией и родительскими характеристиками при остром лимфобластном лейкозе у детей. Лейкемия 2005; 19 : 415–419.

    КАС Google ученый

  • Perentesis JP, Bhatia S, Boyle E, Shao Y, Shu XO, Steinbuch M и др. . Мутации онкогена RAS и результаты терапии острого лимфобластного лейкоза у детей. Лейкемия 2004; 18 : 685–692.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Тарталья М., Мартинелли С., Каззанига Г., Кордедду В., Явароне И., Спинелли М. и др. .Генетические доказательства вклада соматических мутаций PTPN11, связанных с происхождением и стадией дифференцировки, в лейкемогенез при остром лейкозе у детей. Кровь 2004; 104 : 307–313.

    КАС пабмед Google ученый

  • Armstrong SA, Mabon ME, Silverman LB, Li A, Gribben JG, Fox EA и др. . Мутации FLT3 при остром лимфобластном лейкозе у детей. Кровь 2004; 103 : 3544–3546.

    КАС Google ученый

  • Такетани Т., Таки Т., Сугита К., Фуруичи Ю., Исии Э., Ханада Р. и др. . Мутации FLT3 в петле активации домена тирозинкиназы часто обнаруживаются при ОЛЛ у младенцев с перестройками MLL и ОЛЛ у детей с гипердиплоидией. Кровь 2004; 103 : 1085–1088.

    КАС пабмед Google ученый

  • Густафссон Б., Анджелини С., Сандер Б., Кристенссон Б., Хемминки К., Кумар Р. .Мутации в генах BRAF и N-ras при остром лимфобластном лейкозе у детей. Лейкемия 2005; 19 : 310–312.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Кейс М., Мэтисон Э., Минто Л., Хассан Р., Харрисон С. Дж., Боун Н. и др. . Мутация генов, влияющих на путь RAS, часто встречается при остром лимфобластном лейкозе у детей. Рак Res 2008; 68 : 6803–6809.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Николсон Л., Найт Т., Мэтисон Э., Минто Л., Кейс М., Саничар М. и др. . Мутации лимфомы Casitas B при остром лимфобластном лейкозе у детей. Гены Хромосомы Рак 2012; 51 : 250–256.

    КАС пабмед Google ученый

  • Molteni CG, Te Kronnie G, Bicciato S, Villa T, Tartaglia M, Basso G и др. .Мутации PTPN11 при остром лимфобластном лейкозе у детей возникают как вторичное событие, связанное с высокой гипердиплоидией. Лейкемия 2010; 24 : 232–235.

    КАС Google ученый

  • Balgobind BV, Van Vlierberghe P, van den Ouweland AM, Beverloo HB, Terlouw-Kromosoeto JN, van Wering ER и др. . Инактивация NF1, связанная с лейкемией, у детей с Т-ОЛЛ и ОМЛ без признаков нейрофиброматоза. Кровь 2008; 111 : 4322–4328.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Ямамото Т., Исомура М., Сюй Ю., Лян Дж., Ягасаки Х., Камачи Ю. и др. . Мутации PTPN11, RAS и FLT3 при остром лимфобластном лейкозе у детей. Лейк Рез 2006; 30 : 1085–1089.

    КАС пабмед Google ученый

  • Ирвинг Дж., Мэтисон Э., Минто Л., Блэр Х., Кейс М., Холзи С. и др. .Мутации Ras-пути широко распространены при рецидивах острого лимфобластного лейкоза у детей, могут действовать как факторы рецидива и придавать чувствительность к ингибированию MEK. Кровь 2014; 124 : 3420–3430.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Харрисон Си Джей. Геномный анализ определяет индивидуальную терапию при детской лейкемии низкого риска. Раковая клетка 2012; 22 : 139–140.

    КАС пабмед Google ученый

  • Робертс К.Г., Пей Д., Кампана Д., Пейн-Тернер Д., Ли И., Ченг С. и др. . Исходы лечения детей с BCR-ABL1-подобным острым лимфобластным лейкозом, получавших терапию, направленную на риск, на основе уровней минимальной остаточной болезни. J Clin Oncol 2014; 32 : 3012–3020.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Комплексы C, обеспечивающие эффективное убиквитинирование Cdc20 и блокировку контрольных точек.

    Отчет

    Делящиеся дрожжи Apc15 стабилизируют комплексы MCC-Cdc20-APC/C, обеспечивая эффективное убиквитинирование Cdc20 и остановку контрольной точки Графическое резюме

    Авторы Карен М. Мэй, Флора Палди, Кевин Г. Хардвик Мэй и др. анализируют роль делящихся дрожжей Apc14 и Apc15 в регуляции контрольной точки веретена активности APC/C. Apc15 необходим для эффективного оборота Cdc20 и остановки контрольной точки в делящихся дрожжах. Показано, что Apc15 и C-конец Mad3 координируют взаимодействия двух молекул Cdc20 внутри ингибированных комплексов APC/C.

    Highlights D

    Два небольших деления дрожжей APC / C Субъединения Reguty MCC Binding

    D

    APC14 требуется для контрольно-пропускной точки и APC15 для контрольно-пропускной точки

    D

    APC15 Улучшает CDC20 Ubiquitination и оборот

    два Молекулы Cdc20 обнаруживаются в MCC-APC/C, а свободный MCC-Cdc20A накапливается в apc15D

    May et al., 2017, Current Biology 27, 1221–1228 24 апреля 2017 г. ª 2017 Автор(ы). Опубликовано Elsevier Ltd.http://dx.doi.org/10.1016/j.cub.2017.03.013

    Current Biology

    Report Делящиеся дрожжи Apc15 стабилизируют комплексы MCC-Cdc20-APC/C, обеспечивая эффективное убиквитинирование Cdc20 и арест контрольной точки Карен М. Мэй ,1 Флора Палди,1 и Кевин Г. Хардвик1,2,* 1Wellcome

    Доверительный центр клеточной биологии, Эдинбургский университет, King’s Buildings, Max Born Crescent, Эдинбург EH9 3BF, Великобритания //dx.doi.org/10.1016/j.cub.2017.03.013 2Lead

    РЕЗЮМЕ

    Во время митоза клетки должны с чрезвычайно высокой точностью отделить реплицированные копии своего генома от своих дочерних клеток.Ошибки сегрегации приводят к аномальному числу хромосом (анеуплоидии), что обычно приводит к заболеванию или гибели клеток [1]. Хромосомная сегрегация и начало анафазы инициируются под действием мультисубъединичной убиквитинлигазы E3, известной как комплекс, способствующий анафазе, или циклосома (APC/C [2]). APC/C ингибируется контрольной точкой веретена при наличии дефектов прикрепления кинетохор [3, 4]. Здесь мы демонстрируем, что две несущественные субъединицы APC/C (Apc14 и Apc15) регулируют ассоциацию белков контрольных точек веретена в форме комплекса митотических контрольных точек (MCC) с APC/C. Мутанты apc14D демонстрируют повышенную ассоциацию MCC с APC/C и не могут эффективно подавлять контрольную точку. Наоборот, мутанты apc15D обнаруживают сниженную ассоциацию между MCC и APC/C, дефектны в поли-убиквитинировании Cdc20 и дефектны по контрольным точкам. Исследования восстановления in vitro показали, что человеческий MCC-APC/C может содержать две молекулы Cdc20 [5–7]. Используя штамм дрожжей, экспрессирующий два гена Cdc20 с разными метками эпитопов, мы показали с помощью коиммунопреципитации, что это верно in vivo.Связывание MCC со второй молекулой Cdc20 опосредуется через C-концевой блок KEN в Mad3. Несколько неожиданно комплексы, содержащие обе молекулы Cdc20, накапливаются в клетках apc15D, и значение этого наблюдения обсуждается. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Cdc20Slp1 (Slp1 — гомолог Cdc20 у делящихся дрожжей) был идентифицирован несколько лет назад как ключевой эффектор контрольной точки веретена [8, 9], а комплекс митотической контрольной точки (Cdc20-Mad3-Mad2-Bub3) быть наиболее мощным комплексом, стимулирующим анафазу, или ингибитором циклосомы (APC/C) [10]. Кристаллическая структура комплекса митотической контрольной точки

    (MCC) у делящихся дрожжей была решена [11], а недавно методом криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) были получены структуры MCC человека в комплексе с APC/C из рекомбинантных комплексов, продуцируемых в бакуловирусно-инфицированных клетках. клетки насекомых [6, 7]. Эти модели обеспечивают превосходную структурную основу, в рамках которой происходит ингибирование контрольной точки веретена, однако есть несколько областей, требующих дальнейшего изучения. Лаборатория Gould ранее продемонстрировала, что делеция субъединицы Apc14 или Apc15 APC/C делящихся дрожжей не влияет на их убиквитинлигазную активность [12].Apc14 плохо консервативен, но в клетках человека и почкующихся дрожжей было показано, что в отсутствие Apc15 существуют дефекты замалчивания контрольных точек веретена [13-15]. Поэтому мы проанализировали штаммы делящихся дрожжей apc14D и apc15D на наличие дефектов в установлении, поддержании и/или подавлении контрольных точек. Мутанты apc15D обнаруживают дефекты контрольных точек веретена Во-первых, мы использовали чувствительный к холоду мутант бета-тубулина nda3KM311 для анализа способности клеток останавливаться в митозе в отсутствие микротрубочек веретена [16].На рисунке 1А показано, что в то время как клетки apc14D останавливаются, как клетки дикого типа, клетки apc15D демонстрируют серьезные дефекты в этом анализе контрольной точки. Мы также проанализировали способность этих мутантов apc к аресту в ответ на сверхэкспрессию Mad2 и Mps1Mph2 (Mph2 является гомологом киназы Mps1 у делящихся дрожжей) [17, 18] и еще раз обнаружили, что штаммы apc15D были значительно дефектны в отношении ареста (рис. 1B). ). Неспособность реагировать на сверхэкспрессию Mad2 помещает функцию Apc15 ниже по течению пути контрольной точки веретена, поскольку единственным другим белком контрольной точки, необходимым для ареста сверхэкспрессии Mad2, является Mad3, др. ключевой компонент MCC делящихся дрожжей [19].Это предполагает, что Apc15 может играть роль в сборке MCC и/или его связи с APC/C. Чтобы проверить это, мы проанализировали сборку MCC в ненарушенном митозе, синхронизировав клетки в G2 / M с использованием аллеля cdc25-ts. На рис. 1C показано, что сборка MCC мало влияет на отсутствие Apc14 или Apc15. Тем не менее, мы отмечаем, что у мутанта apc15D уровни Cdc20Slp1 и комплекса MCC в 2-3 раза выше и остаются высокими дольше, даже если они не обнаруживают задержки в анафазе (см. Рисунок S1).Когда мы проанализировали способность комплекса MCC связываться с APC/C, мы увидели поразительные эффекты как у штаммов apc14D, так и у apc15D (рис. 2А). Клетки синхронизировали в G2/M и затем запускали в митоз. Уровни MCC, связанные с APC/C, в штаммах apc15D были снижены до уровня, сходного с таковым при отсутствии киназной активности Mps1Mph2 [20]. И наоборот,

    Current Biology 27, 1221–1228, 24 апреля 2017 г. ª 2017 г. Автор (ы). Опубликовано Elsevier Ltd. 1221 Это статья в открытом доступе по лицензии CC BY (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

    A

    B

    C

    Рис. 1. Мутанты apc15D с дефектом контрольной точки (A) Арест контрольной точки. Штаммы nda3 выращивали до логарифмической фазы, а затем переводили на 18°C ​​для деполимеризации микротрубочек и, таким образом, активации контрольной точки веретена. В указанные моменты времени клетки фиксировали в метаноле и оценивали митотический индекс путем анализа уровней и локализации Cdc13GFP (циклин B). Cdc13-GFP локализуется в телах полюсов веретена в начале митоза.Мутант apc14D эффективно останавливает, но мутанты apc15D и mad2D этого не делают. Этот эксперимент был повторен трижды (с подсчетом по меньшей мере 100 клеток на штамм в каждый момент времени), и данные нанесены на график как среднее значение ± стандартное отклонение. (B) Сверхэкспрессия Mad2 и Mph2. Культуры, содержащие плазмиды, экспрессирующие Mad2 с промотора nmt1 или Mph2 с промотора nmt41, индуцировали (тиамин) в течение 18 часов, и митотический индекс оценивали иммуноокрашиванием микротрубочек и длины веретена. Этот эксперимент был повторен дважды (с подсчетом по меньшей мере 100 клеток на штамм в каждый момент времени), и данные нанесены на график как среднее значение ± стандартное отклонение. (C) Сборка MCC не затрагивается. Культуры cdc25-22 cdc20FLAG синхронизировали на G2/M путем блокировки и высвобождения cdc25, образцы клеток брали с 15-минутными интервалами, а Cdc20 подвергали иммунопреципитации (IP) и анализировали на ассоциированные белки контрольных точек (Mad3 и Mad2). Этот эксперимент был повторен три раза, и здесь показан репрезентативный пример. См. также рисунок S1.

    является предметом текущей работы, но не анализировался в дальнейшем в данном исследовании.

    Уровни MCC, связанные в штаммах apc14D, были в 2-3 раза выше, чем в клетках дикого типа (см. количественный анализ на рисунке S2).Самая простая интерпретация этих данных заключается в том, что Apc15 необходим для стабильного связывания MCC с APC/C, что согласуется с дефектами контрольных точек, наблюдаемыми у штаммов apc15D (рис. 1), тогда как функция Apc14 необходима для эффективного высвобождения MCC и подавления контрольных точек. apc14D Mutants Display Checkpoint Silence Defects Для более детального анализа фенотипа apc14D мы использовали анализ сайленсинга контрольных точек, который мы ранее разработали во время исследований протеинфосфатазы 1 [21]. Клетки арестовывают без микротрубочек с помощью мутации nda3 [16], а затем ингибируют активность Aurora с помощью аллеля ark1-as3 [22].Поскольку активность Ark1 необходима для поддержания остановки контрольных точек веретена [21, 23], эти клетки быстро разрушают циклин B. На рисунке 2B показано, что существует явная задержка в деградации циклина B в клетках apc14D, что согласуется с гипотезой о том, что Apc14 играет роль в блокировка КПП. Эта функция сайленсинга Apc14 представляет собой 1222 Current Biology 27, 1221–1228, 24 апреля 2017 г.

    Apc15 Is Cell-Cycle Regulatory Данные транскрипта в PomBase [24] показывают, что экспрессия Apc15 жестко регулируется клеточным циклом, с максимальной экспрессией на G2/ М.Поэтому мы проанализировали уровни белка Apc15 в клеточном цикле. Apc15 является довольно небольшим белком, и мы были обеспокоены тем, что эпитопные метки могут нарушить его функцию. Поэтому мы создали специфические поликлональные антитела к Apc15. На рисунке S2B показано, что уровни Apc15 увеличиваются в 2 раза во время митоза, а на рисунке 2C показано, что уровни Apc15 увеличиваются еще больше во время длительной остановки контрольной точки. Как и в случае многих субъединиц APC/C, Apc15-GFP накапливается в ядрах митотических клеток [25].Мы провели несколько экспериментов, чтобы проверить, важен ли Apc15, вновь синтезированный в G2/M, для функции контрольной точки и подвергается ли сам Apc15 убиквитин-опосредованной деградации. Пока что мы не нашли четких доказательств того, что эта регуляция физиологически важна для митоза (см. рис. S2). На данный момент у нас есть две простые гипотезы относительно функции Apc15: (1) Apc15p может действовать как фактор нагрузки, сначала связываясь с MCC, а затем помогая ему ассоциироваться с сердцевинной частицей APC/C, или (2) Apc15 может образовывать важная часть стыковочного узла MCC на APC/C.Чтобы различать эти способы действия, мы проанализировали ассоциацию Apc15 с белками APC/C и MCC в лизатах дрожжей.

    A

    C

    B

    D

    курсы. Культуры cdc25-22 apc4-TAP mad3-GFP синхронизировали на G2/M путем блокировки и высвобождения cdc25, образцы клеток брали с 15-минутными интервалами, а Apc4-TAP удаляли и анализировали на наличие ассоциированных белков контрольных точек (Mad3 и Mad2) . Клетки из каждой временной точки фиксировали в метаноле и количество двуядерных клеток определяли окрашиванием ДНК DAPI. Этот эксперимент был повторен дважды, и здесь показан репрезентативный пример. (B) Анализ молчания контрольной точки. Штаммы nda3KM-311 cdc13-GFP останавливали путем сдвига до 18°С для деполимеризации микротрубочек и, таким образом, активации контрольной точки веретена. Затем киназу Ark1-as ингибировали 5 мМ 1NM-PP1 и образцы живых клеток анализировали с 15-минутными интервалами. Ингибирование Ark1 активирует APC, и Cdc13-GFP быстро разрушается в клетках дикого типа.Митотический индекс оценивали в живых клетках путем анализа уровней и локализации Cdc13-GFP (циклин B). В задержанных клетках это ядро ​​с ярким сигналом на телах полюсов веретена (SPB). Количество клеток, которые разлагают Cdc13-GFP, показано в виде процента арестованных клеток при t = 0. Этот эксперимент повторяли не менее трех раз (с подсчетом не менее 100 клеток на штамм в каждый момент времени), и данные нанесены на график. как среднее значение ± стандартное отклонение. (C) Мутанты nda3-KM311 выращивали до логарифмической фазы, а затем переводили на 18°C ​​на 6 часов, беря временные точки с 2-часовыми интервалами.Затем иммуноблоты цельных клеток анализировали на уровни Apc15 Mad3 и тубулина. Этот эксперимент был повторен три раза, и данные представлены на графике как среднее значение ± стандартное отклонение. См. Рисунок S2B для количественного определения уровней Apc15 в течение клеточного цикла. (D) Клетки арестовывали в метафазе посредством ареста nda3, и готовили лизаты, а затем иммунодеплетировали для комплексов APC/C посредством четырех раундов иммунопреципитации Apc1-GFP. Затем Apc15 подвергали иммунопреципитации из конечного супернатанта. Затем пять наборов шариков анализировали на наличие ассоциированных белков Cdc20 и контрольных точек, обнаруживая высокие уровни свободного Apc15 после истощения APC/C.Этот эксперимент был повторен дважды. См. также рисунок S2.

    представлял собой свободный пул Apc15p, и для того, чтобы он мог взаимодействовать с MCC, мы провели иммунодеплецию Apc1-GFP из митотических экстрактов. Как и ожидалось, Apc15 ко-иммунопреципитирует

    с Apc1-GFP (рис. 2D). Никакой Apc15 не остается связанным с Apc1-GFP в экстракте после трех раундов иммунодеплеции Apc1-GFP, однако все еще существует значительный пул свободного Apc15. Current Biology 27, 1221–1228, 24 апреля 2017 г. 1223

    Важно отметить, что когда мы иммунопреципитировали этот свободный пул Apc15, он не был связан с Mad3, Mad2 или Cdc20 (рис. 2D).Этот эксперимент показывает, что, хотя имеется значительный пул Apc15, не связанный с APC/C, он не был связан с комплексом MCC или белками в нем. Это противоречит модели, в которой Apc15 действует как фактор загрузки MCC, поскольку ожидается, что он будет связывать компоненты MCC независимо от связывания APC/C. Роль свободного пула Apc15 остается неясной, но его существование, скорее всего, объясняет, почему не было значимого фенотипа при истощении транскрипции Apc15 (Рисунки S2D-S2F). Делящиеся дрожжи Apc15 необходимы для эффективного убиквитинирования Cdc20. Делеция Apc15 не влияла на способность клеток собирать MCC, но мы отметили, что уровни Cdc20 и MCC дольше оставались высокими в apc15D, чем в клетках дикого типа (рис. 1C). ).Это предполагает, что Apc15 может регулировать уровни белка Cdc20 и что он может быть необходим для эффективного убиквитинирования и/или деградации Cdc20. Чтобы определить, так ли это, мы арестовали клетки в метафазе, используя mts3-1 [26], мутантную протеасому, которая не требует функциональной контрольной точки для ареста, а затем иммунопреципитировали Cdc20FLAG. Была надежда, что мутация mts3-1 стабилизирует убиквитин-модифицированные формы Cdc20 из-за дефектного действия протеасом. Когда мы исследовали иммуноблоты на Cdc20, мы теперь могли обнаружить дискретную лестницу из более медленно мигрирующих полос (рис. 3А и 3В).Добавление фосфатазы не влияло на эти полосы, но лестница удалялась в экстрактах, обработанных рекомбинантной деубиквитиназой USP2 [27]. Это показывает, что Cdc20 накапливается в полиубиквитинированных формах в этих митотически арестованных клетках mts3. Полиубиквитинирование Cdc20 зависит от образования МСС [28, 29]. Как и ожидалось, у штаммов mad3D и mad2D, не способных образовывать MCC, убиквитинирование Cdc20 в значительной степени отменялось. Важно отметить, что в клетках apc15D Cdc20 все еще был убиквитинирован, но имело место накопление молекул Cdc20 с более короткими (приблизительно от одной до четырех) цепями убиквитина (Ub) (рис. 3B).Это указывает на то, что у делящихся дрожжей удаление Apc15 не блокирует начальное связывание MCC с APC/C и последующее убиквитинирование Cdc20, но что Apc15 необходим для процессивного убиквитинирования Cdc20. Это согласуется с нашим наблюдением, что меньше MCC связывается с APC/C в клетках apc15D (рис. 2А). Мы предполагаем, что MCC часто «отпадает» от частицы APC/C, лишенной Apc15, до того, как более длинные цепи убиквитина могут быть добавлены к Cdc20, что приводит к снижению процессивности убиквитинирования Cdc20.Как следствие, белок Cdc20 стабилизируется в клетках apc15D и накапливаются уровни свободных MCC (см. рисунки S1A и S1B). Дальнейший анализ показал, что мутанты mad3-ken2 также демонстрируют пониженное убиквитинирование и что двойной мутант mad3-ken2 apc15D совершенно неспособен к полиубиквитинированию Cdc20 (рис. 3А). Это предполагает, что Mad3-KEN2 и Apc15 оба участвуют в стабилизации ключевых взаимодействий MCC-APC/C у делящихся дрожжей, которые необходимы для эффективного убиквитинирования Cdc20 и для ареста контрольных точек.Это хорошо согласуется с сопроводительной рукописью, где показано, что KEN2 и его консервативные фланкирующие мотивы ABBA усиливают ингибирование Cdc20-APC/C и арест контрольной точки веретена [30]. 1224 Текущая биология 27, 1221–1228, 24 апреля 2017 г.

    MCC делящихся дрожжей может содержать две молекулы Cdc20, а связывание второй молекулы зависит от Mad3-KEN2, но не от Apc15 Musacchio и его коллеги предположили несколько лет назад, что вторая молекула Cdc20 в комплексах MCC может помочь объяснить необходимость двух консервативных KEN-боксов в Mad3/BubR1 и аспекты оборота Cdc20 [2, 29].Затем в исследованиях in vitro было доказано, что MCC человека может связывать вторую молекулу Cdc20, позволяя ей ингибировать активный Cdc20-APC/C [5]. Недавние исследования крио-ЭМ показали, что при восстановлении MCC-APC/C человека в клетках насекомых действительно существуют комплексы MCC, содержащие две молекулы Cdc20 [6, 7]. Чтобы различать две молекулы Cdc20, мы будем называть их формой, связанной с MCC (Cdc20M), и формой, связанной с APC/C или активатором (Cdc20A). Чтобы предоставить формальное доказательство наличия второй молекулы Cdc20 в живой системе, мы создали штамм делящихся дрожжей, содержащий вторую копию гена Cdc20Slp1.Эта копия имеет внутреннюю метку 33FLAG [31], позволяющую легко отличить ее от первой копии, которая имеет С-концевую метку 33HA (гемагглютинин). Обе эти формы Cdc20Slp1 функциональны и связывают APC/C (см. ниже). Если две копии Cdc20 присутствуют в MCC, то два белка будут совместно иммунопреципитироваться из митотических экстрактов. Рисунок 3B показывает, что это так, что их взаимодействие зависит от Mad3p и, что важно, их взаимодействие зависит от обоих консервативных блоков Mad3-KEN.Известно, что первый KEN-бокс (KEN1) имеет решающее значение для прямого связывания Cdc20 и образования MCC [11], но функция второго KEN-бокса (KEN2) менее изучена [32]. Широко признано, что KEN2 необходим для функционирования контрольно-пропускного пункта, но не для формирования MCC. В BubR1 он может конкурировать с субстратами за взаимодействие APC/C in vitro [32]. Наш вывод о том, что Mad3-KEN2 необходим для взаимодействия со второй молекулой Cdc20, согласуется с исследованием человека, в котором оба D-бокса и второй KEN-бокс в BubR1 оказались необходимыми [5], а также с недавней крио-ЭМ. структур [6, 7].Важно отметить, что наш эксперимент по коиммунопреципитации Cdc20-Cdc20 проводится в экстрактах цельных клеток, полученных из митотических делящихся дрожжевых клеток. Наши результаты подтверждаются в прилагаемой рукописи делящихся дрожжей [30], где показано, что две формы Cdc20 (одна меченая и одна немеченая) взаимодействуют в митозе. Одним из способов формирования этих комплексов Cdc20-Cdc20 было бы образование димеров MCC в целом либо просто с самим собой, либо на большей платформе. В этой модели все члены комплекса MCC будут содержать две молекулы, а не только Cdc20.Чтобы проверить это, мы сконструировали штаммы делящихся дрожжей, экспрессирующие нормальные Mad3 и Mad3-GFP, и задались вопросом, могут ли две формы Mad3 совместно иммунопреципитироваться в митотически арестованных клетках. Рисунок S3B показывает, что это не так, что исключает димеризацию MCC. Модель, предложенная в исследованиях на людях [5], заключалась в том, что MCC (Cdc20M-Mad3-Mad2) связывает и ингибирует активный комплекс Cdc20AAPC/C с образованием Cdc20M-Mad3-Mad2-Cdc20A-APC/C (содержащего две молекулы Cdc20). Наш мутант apc15 позволил нам протестировать эту модель на делящихся дрожжах.Если бы это было так, можно было бы предсказать, что мутант apc15, который нарушает взаимодействие между MCC и APC/C, будет уменьшать или устранять взаимодействие между двумя молекулами Cdc20. Рисунок 3B показывает, что это не так, поскольку эффективная коиммунопреципитация

    A

    B

    C

    Cdc20-FLAG и Cdc20-HA все еще наблюдалась в клетках apc15D; действительно, эти комплексы накапливались у мутанта (см. также рис. S3A). Рисунок 2A демонстрирует значительное снижение уровня MCC, связанного с APC/C у мутантов apc15D, однако на рисунке 3B показаны комплексы, содержащие несколько молекул Cdc20. Чтобы подтвердить, что эти комплексы Cdc20 не были связаны с APC/C, мы истощили APC/C из экстрактов apc15D с помощью четырех раундов иммунодеплеции Cut9-GFP и спросили, содержит ли еще свободный пул MCC две молекулы Cdc20 (Cdc20-HA –Mad3–Mad2–Cdc20FLAG). На фигуре 4А показано, что это так, и что в экстрактах мутанта apc15D значительно больше этого комплекса по сравнению с экстрактами дикого типа. Мы отмечаем, что это наблюдение не является

    Рисунок 3. Мутанты apc15D имеют значительные дефекты в процессах убиквитинирования Cdc20Slp1, а делящиеся дрожжи MCCCdc20-APC/C содержат две молекулы Cdc20 (A) Эксперименты по убиквитинированию Cdc20.Все указанные штаммы содержат мутацию протеасомы mts3-1, чтобы блокировать клетки в митозе независимо от контрольной точки веретена и обогащать полиубиквитинированные формы клеточных белков. Культуры были переведены на 36°С за 3 часа до сбора. Лизаты цельных клеток готовили в присутствии ингибиторов Dub, и Cdc20-FLAG подвергали иммунопреципитации, а затем иммуноблотингу для Cdc20FLAG. При длительном воздействии обнаруживается лестница из медленно мигрирующих полос, которые редуцированы у мутантов mad3 и apc15. Указанные лизаты обрабатывали рекомбинантным hsUSP2 (де-убиквитиназой) или лямбда-фосфатазой перед запуском геля.Лямбда-фосфатаза не действует, но USP2 отменяет лестницу, подтверждая, что это связано с модификацией убиквитином. Различные модифицированные формы Cdc20 накапливаются у мутантов mts3 и apc15Dmts3 с более короткими цепями в отсутствие Apc15. Они обозначены зеленой и красной маркировкой на соответствующих антиубиквитиновых пятнах. Этот эксперимент был повторен трижды. (B) Указанные дорожки из (A) расширены, чтобы выделить различные модифицированные формы Cdc20, которые накапливаются в мутантах mts3, apc15Dmts3 и apc14Dmts3.В частности, в отсутствие Apc15 есть более короткие цепи (обведены красным). (C) Коиммунопреципитат Cdc20-FLAG и Cdc20-HA. Клетки, содержащие обе формы Cdc20, синхронизировали в митозе (через 60 мин после блокировки и высвобождения cdc25), готовили лизаты и иммунопреципитировали Cdc20-FLAG. Затем иммунопреципитаты подвергали иммуноблоттингу и анализировали на наличие связанных Cdc20-HA, Mad3-GFP, Mad2 и Apc15. Звездочка указывает на коиммунопреципитацию Cdc20Cdc20. Этот эксперимент был повторен трижды.% метафазных клеток указан под пятном для шести штаммов. См. также рисунок S3.

    обязательно в соответствии с предложенной моделью ингибирования Cdc20APC/C у человека [5] и предлагают две модели для объяснения наших наблюдений за делящимися дрожжами: (1) Apc15 образует важную часть сайта связывания MCC на APC/C. Как следствие, в клетках apc15D MCC (Cdc20M-Mad3-Mad2) может предпочтительно связываться со свободным Cdc20, а не с комплексами Cdc20A-APC/C. Это изолирует Cdc20 и сформирует свободный пул Cdc20MMad3-Mad2-Cdc20A.Такая секвестрация вполне может помочь ингибировать действие Cdc20, и сопроводительная рукопись [30] показывает, что это имеет место, когда уровни Cdc20 снижены. Однако отметим, что Cdc20M в этих Current Biology 27, 1221–1228, 24 апреля 2017 г. 1225

    A

    B

    Рис. ) Комплекс MCC (Cdc20M-Mad3-Mad2)-Cdc20A можно обнаружить в супернатанте, обедненном APC/C, и этот комплекс накапливается в apc15D. Митотические лизаты были приготовлены из cdc25-22, cdc20-HA, cdc20-FLAG, Apc6Cut9-GFP (через 60 минут после блокировки и высвобождения cdc25), а затем иммунодеплетированы для комплексов APC/C посредством четырех раундов иммунодеплеции cut9apc6-GFP.Cdc20-FLAG затем подвергали иммунопреципитации из полученного супернатанта и иммуноблоттингу для поиска связанных белков Cdc20-HA и контрольных точек. MCC (Cdc20M-Mad3-Mad2)-Cdc20A подвергается иммунопреципитации без Apc6Cut9-GFP или Apc15. Этот эксперимент был повторен дважды. (B) Модели связывания MCC и убиквитинирования Cdc20 в клетках дикого типа и мутантах apc15. (i) Когда контрольная точка включена, MCC связывается с Cdc20-APC/C, и у делящихся дрожжей это взаимодействие стабилизируется Apc15. C-конец Mad3 (KEN2 и связанные мотивы ABBA) является критическим для этого стабильного взаимодействия со второй молекулой Cdc20 (Cdc20A). (iia) В клетках apc15D MCC может предпочтительно связывать свободный Cdc20A. (iib) В отсутствие Apc15 комплекс MCC слабо связан, а Cdc20M неэффективно убиквитинируется. Он высвобождается с короткими цепями убиквитина в форме Cdc20M-Mad3-Mad2Cdc20A. Обратите внимание, что обе молекулы Cdc20 высвобождаются из APC/C. (iii) В клетках дикого типа Cdc20M эффективно полиубиквитинируется, что приводит к его деградации. Функция Apc14 необходима для эффективного высвобождения MCC.

    1226 Current Biology 27, 1221–1228, 24 апреля 2017 г.

    комплексы не будут убиквитинированы, если только комплекс не будет связан с APC/C.(2) МКЦ связывается с Cdc20A-APC/C, но их взаимодействие ослабляется в отсутствие Apc15, а комплекс MCCCdc20A-APC/C довольно короткоживущий. Следствием этого кратковременного взаимодействия с APC/C является то, что оно должно приводить к снижению процессивности убиквитинирования Cdc20M в клетках apc15D. Это согласуется с короткими цепями Ub, которые мы наблюдали на Cdc20 в apc15D (рис. 3B). Важно отметить, что когда комплекс MCC диссоциирует, он берет с собой активатор Cdc20A с образованием свободного Cdc20M-Mad3Mad2-Cdc20A.Обратите внимание, что эти модели не исключают друг друга. Важно включить свободный комплекс Cdc20M-Mad3-Mad2-Cdc20A в обзоры действия MCC и ингибирования Cdc20 (см. Рисунок 4B). Выводы. На первый взгляд, у делящихся дрожжей Apc15 простая роль, помогающая MCC стабильно связываться с сердцевинной частицей APC/C, и это согласуется с их положением в недавних крио-ЭМ структурах высокого разрешения APC/C. С. Почкующиеся дрожжи и исследования человека in vitro показали, что Apc15 необходим для эффективного убиквитинирования Cdc20 и последующего высвобождения MCC [13, 15].Основываясь на крио-ЭМ моделях, было высказано предположение, что Apc15 человека претерпевает конформационные изменения для смещения MCC в подходящую ориентацию для аутоубиквитинирования Cdc20 [6, 7]. Наше исследование согласуется с этим, поскольку Cdc20Slp1 демонстрирует сниженное убиквитинирование и стабилизируется в клетках apc15D делящихся дрожжей (рис. 3А). Однако Apc15 делящихся дрожжей также необходим для стабильного связывания MCC и, таким образом, для ареста контрольной точки веретена, чего нет в человеческих и почкующихся дрожжевых клетках. Важно отметить, что мы также предоставляем доказательства in vivo для комплексов, содержащих две молекулы Cdc20 в делящихся дрожжах.Взаимодействие со второй молекулой Cdc20 опосредуется С-концом Mad3, включая его второй KEN-бокс и близлежащие мотивы АВВА [32-34]. Наша работа и сопроводительная рукопись [30] описывают исследования делящихся дрожжей in vivo, которые обеспечивают важное подтверждение моделей, предложенных в исследованиях восстановления in vitro белков MCC человека и их взаимодействий с APC/C. Здесь представлены новые результаты, где, как это ни парадоксально, хотя мутанты apc15D демонстрируют пониженные уровни MCC, связанных с APC/C (рис. 2А), они также накапливают комплексы Cdc20-Cdc20 (рис. 3В).Мы предложили две модели для создания свободного пула Cdc20M-Mad3-Mad2-Cdc20A, который мы наблюдаем у мутантов apc15D (см. Рисунок 4B). У делящихся дрожжей мы обнаружили, что делеция Apc14 приводит к дефектам подавления контрольных точек. В его отсутствие уровни MCC, связанные с APC/C, превышают нормальные, и продолжаются эксперименты, чтобы понять механизм его действия. Будет интересно посмотреть, в отсутствие Apc14 MCC просто более тесно связывается с APC/C, или же Apc14 играет активную роль, аналогичную p31comet (не сохраняется у S.pombe), TRIP13 или шаперона CCT в разрушении комплексов MCC-APC/C [35, 36].

    (iv) Блокпост выключен; Теперь APC/C может связываться с активатором Cdc20A, который может катализировать полиубиквитинирование секурина и циклина, что приводит к началу анафазы. См. также рисунок S4.

    ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПРОЦЕДУРЫ

    11. Чао В.К., Кулкарни К., Чжан З., Конг Э.Х. и Барфорд Д. (2012). Структура комплекса митотических контрольных точек. Природа 484, 208–213.

    См. дополнительные экспериментальные процедуры.

    12. Юн Х.Дж., Феоктистова А., Вулф Б.А., Дженнингс Дж. Л., Линк А.Дж., Гулд К.Л. (2002). Протеомный анализ идентифицирует новые компоненты комплексов, стимулирующих анафазу делящихся и почкующихся дрожжей. Курс. биол. 12, 2048–2054 гг.

    ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ Дополнительная информация включает дополнительные экспериментальные процедуры и четыре рисунка. Ее можно найти вместе с этой статьей в Интернете по адресу http://dx.doi.org/10.1016/j.cub.2017.03.013. АВТОРСКИЙ ВКЛАД К.М.М. задумал и спроектировал эксперименты, собрал данные, провел анализ и интерпретацию данных и набросал рисунки.Ф.П. генерировали конструкции Slp1 и штаммы дрожжей и проводили определенные коиммунопреципитации Cdc20. К.Г.Х. задумал проект, помог с анализом и интерпретацией данных и построением рисунков, а также написал рукопись. Все авторы рассмотрели рукопись. БЛАГОДАРНОСТИ Мы благодарим Silke Hauf за передачу данных перед публикацией. Мы особенно благодарны Джоанне Страчан и Лиз Бейн за их советы по анализу убиквитинирования, ингибиторам DUB и USP2. Мы благодарим Marjolein Mijnders и Kostas Paraskevopoulos за их помощь в создании антител против Apc15; Кэти Гулд и Силке Хауф для штаммов дрожжей; Шелли Сазер для плазмид; Иван Юань за помощь с моделями; и всем членам группы Hardwick за поддержку и комментарии к рукописи. Эта работа была поддержана начальным вознаграждением от Wellcome Trust (в KGH; 108105), основным грантом Wellcome Trust Center for Cell Biology (0) и аспирантурой Wellcome Trust (в FP; 109091). Получено: 21 января 2017 г. Пересмотрено: 3 марта 2017 г. Принято: 8 марта 2017 г. Опубликовано: 30 марта 2017 г. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Gordon, D.J., Resio, B., and Pellman, D. (2012). Причины и последствия анеуплоидии при раке. Нац. Преподобный Жене. 13, 189–203. 2. Приморак И. и Мусаккио А. (2013). Panta rhei: APC/C в стабильном состоянии.Дж. Клеточная биология. 201, 177–189. 3. Лондон, Н., и Биггинс, С. (2014). Динамика сигнализации в отклике контрольной точки шпинделя. Нац. Преподобный Мол. Клеточная биол. 15, 736–747. 4. Мусаккио, А. (2015). Молекулярная биология динамики передачи сигналов контрольной точки сборки веретена. Курс. биол. 25, Р1002–Р1018. 5. Изава Д. и Пайнс Дж. (2015). Комплекс митотической контрольной точки связывает второй CDC20, чтобы ингибировать активный APC/C. Природа 517, 631–634. 6. Альфьери К., Чанг Л., Чжан З., Ян Дж., Маслен С., Скехель М. и Барфорд Д.(2016). Молекулярные основы регуляции APC/C контрольной точкой узла шпинделя. Природа 536, 431–436. 7. Ямагучи М., Вандерлинден Р., Вайсманн Ф., Цяо Р., Дубе П., Браун Н.Г., Хазельбах Д., Чжан В., Сидху С.С., Петерс Дж.М. и др. др. (2016). Крио-ЭМ связанного с комплексом митотической контрольной точки APC/C выявляет реципрокную и конформационную регуляцию лигирования убиквитина. Мол. Ячейка 63, 593–607. 8. Хван Л.Х., Лау Л.Ф., Смит Д.Л., Мистрот К.А., Хардвик К.Г., Хванг Э.С., Амон А. и Мюррей А.В. (1998). Почкующиеся дрожжи Cdc20: цель контрольной точки веретена. Наука 279, 1041–1044.

    13. Фостер С.А. и Морган Д.О. (2012). Субъединица APC/C Mnd2/Apc15 способствует аутоубиквитинированию Cdc20 и инактивации контрольной точки сборки веретена. Мол. Ячейка 47, 921–932. 14. Мансфельд Дж., Коллин П., Коллинз М.О., Чоудхари Дж.С. и Пайнс Дж. (2011). APC15 управляет оборотом MCC-CDC20, чтобы контрольная точка узла шпинделя реагировала на прикрепление кинетохор. Нац. Клеточная биол. 13, 1234–1243.15. Узунова К., Дай Б.Т., Шутц Х., Ладурнер Р., Петцольд Г., Тойода Ю., Джарвис М.А., Браун Н.Г., Позер И., Новачкова М. и др. др. (2012). APC15 опосредует аутоубиквитилирование CDC20 с помощью APC/C(MCC) и разборку комплекса митотических контрольных точек. Нац. Структура Мол. биол. 19, 1116–1123. 16. Хираока Ю., Тода Т. и Янагида М. (1984). Ген NDA3 делящихся дрожжей кодирует бета-тубулин: чувствительная к холоду мутация nda3 обратимо блокирует образование веретена деления и движение хромосом в митозе.Ячейка 39, 349–358. 17. Хе Х., Паттерсон Т.Е. и Сазер С. (1997). Белок mad2p контрольной точки веретена Schizosaccharomyces pombe блокирует анафазу и генетически взаимодействует с комплексом, способствующим анафазе. проц. Натл. акад. науч. США 94, 7965–7970. 18. Хе Х., Джонс М.Х., Уини М. и Сазер С. (1998). Mph2, член Mps1-подобного семейства протеинкиназ двойной специфичности, необходим для контрольной точки веретена у S. pombe. Дж. Клеточные науки. 111, 1635–1647. 19. Миллбанд Д.Н. и Хардвик К.Г. (2002). Mad3p делящихся дрожжей необходим Mad2p для ингибирования комплекса, способствующего анафазе, и локализуется на кинетохорах Bub1p-, Bub3p- и Mph2p-зависимым образом. Мол. Клетка. биол. 22, 2728–2742. 20. Зич Дж., Сочай А.М., Сайред Х.М., Милн Л., Кук А.Г., Окура Х., Раппсилбер Дж. и Хардвик К.Г. (2012). Киназная активность делящихся дрожжей Mph2 необходима для того, чтобы Mad2 и Mad3 стабильно связывались с комплексом, стимулирующим анафазу. Курс. биол. 22, 296–301. 21. Ваностхейс, В., и Хардвик, К.Г. (2009). Новый механизм подавления контрольной точки веретена, зависимый от протеинфосфатазы 1. Курс. биол. 19, 1176–1181. 22. Кох А., Круг К., Пенгелли С., Мацек Б. и Хауф С. (2011). Митотические субстраты киназы Aurora, роль которых в регуляции хроматина идентифицирована с помощью количественной фосфопротеомики делящихся дрожжей. науч. Сигнал. 4, р6. 23. Петерсен, Дж., и Хаган, И.М. (2003). Киназа/сурвивин S. pombe aurora необходима для конденсации хромосом и реакции прикрепления контрольной точки веретена. Курс. биол. 13, 590–597. 24. Вуд, В., Харрис, М.А., Макдауэлл, М.Д., Резерфорд, К., Воан, Б.В., Эрлер, Дж., Керси, П.Дж., и Оливер, Стейнс, Д.М., Аслетт, М., Лок, А. , Ба С.Г. (2012). PomBase: всеобъемлющий онлайн-ресурс по делящимся дрожжам. Нуклеиновые Кислоты Res. 40, Д695–Д699. 25. Хайнрих С., Гейссен Э.М., Каменц Дж., Траутманн С., Видмер С., Древе П., Кноп М., Радде Н., Хазенауэр Дж. и Хауф С. . (2013). Детерминанты надежности сигнализации контрольной точки узла шпинделя. Нац. Клеточная биол.15, 1328–1339. 26. Гордон, К., МакГерк, Г., Уоллес, М., и Хасти, Н.Д. (1996). Условно-летальный мутант в субъединице протеазы 26 S делящихся дрожжей mts3+ дефектен при переходе от метафазы к анафазе. Дж. Биол. хим. 271, 5704–5711.

    9. Ким С.Х., Лин Д.П., Мацумото С., Китазоно А. и Мацумото Т. (1998). Делящиеся дрожжи Slp1: эффектор Mad2-зависимой контрольной точки веретена. Наука 279, 1045–1047.

    27. Хэнкс С., Коулман К., Саммерсгилл Б., Мессахель Б., Уильямсон, Д., Причард-Джонс, К. , Стреффорд, Дж., Суонсбери, Дж., Пладжа, А., Шипли, Дж., и Рахман, Н. (2006). Сравнительная геномная гибридизация и анализ мутаций BUB1B при раке у детей, связанном с синдромом мозаичной пестрой анеуплоидии. Рак Летт. 239, 234–238.

    10. Судакин В., Чан Г.К., Йен Т.Дж. (2001). Ингибирование контрольной точки APC/C в клетках HeLa опосредуется комплексом BUBR1, BUB3, CDC20 и MAD2. Дж. Клеточная биология. 154, 925–936.

    28. Кинг Э.М., ван дер Сар, С.Дж., и Хардвик, К.Г. (2007). Коробки Mad3 KEN обеспечивают обмен как Cdc20, так и Mad3 и имеют решающее значение для контрольной точки шпинделя. ПЛОС ОДИН 2, e342.

    Current Biology 27, 1221–1228, 24 апреля 2017 г. 1227

    29. Варетти Г., Гуида К., Сантагуида С., Чироли Э. и Мусаккио А. (2011). Гомеостатический контроль остановки митоза. Мол. Ячейка 44, 710–720. 30. Сьюарт, К., и Хауф, С. (2017). Различная функциональность сайтов связывания Cdc20 в комплексе митотических контрольных точек.Курс. биол. Опубликовано в Интернете 30 марта 2017 г. http://dx.doi.org/10.1016/j.cub.2017.03.007. 31. Зич Дж., Мэй К., Параскевопулос К., Сен О., Сайред Х.М., ван дер Сар С., Патель Х., Мореско Дж. Дж., Саркешик А., Йейтс Дж. Р. , III., и др. (2016). Киназа Mps1Mph2 фосфорилирует Mad3, чтобы ингибировать Cdc20Slp1-APC/C и поддерживать остановку контрольных точек веретена. Генетика PLoS. 12, e1005834. 32. Лара-Гонсалес П., Скотт М.И., Диез М., Сен О. и Тейлор С.С. (2011). BubR1 блокирует привлечение субстрата к APC/C зависимым от KEN-бокса образом.Дж. Клеточные науки. 124, 4332–4345.

    1228 Current Biology 27, 1221–1228, 24 апреля 2017 г.

    33. Ди Фиоре, Б., Вурценбергер, К., Дэйви, Н.Э., и Пайнс, Дж. (2016). Комплексу митотических контрольных точек требуется эволюционно консервативная кассета для связывания и ингибирования активного APC/C. Мол. Ячейка 64, 1144–1153. 34. Тромер Э., Баде Д., Снел Б. и Копс Г.Дж. (2016). Филогеномика подсказала открытие новой консервативной кассеты коротких линейных мотивов в BubR1, необходимой для контрольной точки веретена.

    Добавить комментарий